基于平行人工膜滲透性分析法初步預測鹽酸吡格列酮制劑生物等效性

張丹丹，王 松，李玉杰，張冬梅，于明艷，楊蕙如，陳德俊

（山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室，山東省仿制藥一致性評價工程技術研究中心，山東 濟南 250101）

鹽酸吡格列酮（pioglitazone hydrochloride）是一種噻唑烷二酮類胰島素增敏劑，最早由日本武田藥品工業株式會社（Takeda）成功合成，臨床主要用于治療2型糖尿病[1]。1999年7月，鹽酸吡格列酮片獲FDA批準上市，商品名為ACTOS（艾可拓）。日本藥品審評中心（PMDA）公開的《IF文件》中顯示：20 ℃下，鹽酸吡格列酮在pH 1.1，pH 2.0，pH 5.0，pH 7.0溶液中的溶解度分別為6.7，0.42 ，0.00026，0.000093 mg/ml，因此，鹽酸吡格列酮屬于pH依賴性藥物。在生物藥劑學分類系統（biopharmaceutics classification system, BCS）中，鹽酸吡格列酮屬于II類，即低溶解性、高滲透性藥物[2]。

口服固體制劑在人體內胃腸道的吸收取決于其溶出行為、生理條件下藥物的溶解度和藥物的滲透性。普通的溶出度實驗可用于體外模擬胃腸道的崩解和溶出，但其反映的藥物溶出行為變化不具臨床意義[3]，而人體生物等效性實驗成本高，耗時長，失敗風險大。測定藥物滲透性最直接的方法是人體小腸灌流法，但是人體試驗成本高且操作復雜。Caco-2細胞模型是國內外普遍采用的藥物滲透性研究工具，Caco-2細胞來源于人的直腸癌，結構和功能與人小腸上皮細胞類似，廣泛應用于藥物轉運機制、藥物吸收等方面的研究，缺點是細胞培養周期長且易受污染[4]。動物模型也是研究藥物滲透性的常用方法之一，主要包括體內小腸灌流試驗和原位小腸灌流試驗。體內小腸灌流試驗更接近體內真實滲透情況。原位小腸灌流試驗則模型相對簡單，影響因素較少，參數易于分析。但是相關藥物滲透性試驗主要需用動物，試驗成本高，時間長，需要考慮倫理學方面的問題，還可能出現假陰性的結果[4]。平行人工膜滲透性分析法（parallel artificial membrane permeability assay，PAMPA）是采用涂卵磷脂溶液的聚偏氟乙烯或聚碳酸酯膜模擬小腸上皮細胞以測定被動轉運機制吸收的藥物滲透性，其測定結果與人體小腸灌流法呈正相關[5-6]。采用PAMPA研究藥物滲透性具有操作簡便、效率高、重現性好等特點，且絕大多數口服固體制劑是通過被動轉運機制滲透進入血液[7]，因此，其在藥物處方篩選及仿制藥一致性評價等方面應用較廣泛。

本實驗將溶出度儀與人工仿生膜滲透性預測系統結合，建立了基于體外溶出-滲透速率測試結果的模型，具有一定的體外溶出與體內吸收相關性，用于預測鹽酸吡格列酮片（膠囊）的生物等效性，并初步考察了輔料對鹽酸吡格列酮原料滲透性的影響。受試制劑和參比制劑說明書中均表示空腹與餐后原形藥物的藥代動力學參數無明顯差異，本次實驗以空腹為代表。

1 材料與儀器

1.1 儀器

MacroFLUXTM型光纖藥物溶出度與滲透速率測試系統（美國Pion Inc公司）；MS105DU型電子天平與S400-K pH計（Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸吡格列酮對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100634-202104，純度：100 %）；參比制劑（鹽酸吡格列酮片，Teva Takeda，商品名：艾可拓，規格：15 mg，批號：11887977）；受試制劑A（鹽酸吡格列酮片，規格：30 mg，已通過一致性評價），受試制劑B（鹽酸吡格列酮片，規格：15 mg），受試制劑C（鹽酸吡格列酮膠囊，規格：15 mg），3批受試制劑均來自山東省2021年風險監測抽驗；滲透速率接收池（帶膜）（美國Pion Inc公司，批號：520926）；磷脂溶液（美國Pion Inc公司，批號：520852）；ASB（pH 7.4）溶液（美國Pion Inc公司，批號：520945）；藥物溶出模擬液固體粉末（英國Biorelevant公司，批號：FFF-0421-B）；氫氧化鈉、氯化鈉、無水磷酸二氫鈉、鹽酸、冰醋酸、二甲基亞砜（DMSO）均為分析純；實驗用水為純化水。

2 方法與結果

2.1 MacroFLUXTM藥物溶出度與滲透速率測試系統

本系統（見圖1）中溶出杯作為供體室代表胃腸道，以不同pH值的溶出介質（空腹：胃液pH 1.6，腸液pH 6.5；飽腹：胃液腸液pH 5.0）進行空飽腹實驗（本實驗以空腹為代表），用涂以磷脂溶液的人工仿生膜模擬胃腸道細胞膜，受體室中加入ASB緩沖液（pH 7.4）用于模擬血液。制劑置于溶出杯中模擬藥物的溶出行為，溶解后的藥物通過仿生膜進入受體室模擬藥物的吸收過程。藥物濃度變化通過原位光纖DAD檢測器實時檢測，實現藥物溶出和滲透吸收同時監測。通過關鍵質量參數考察藥物的釋放與吸收過程，預測制劑間是否生物等效。

圖1 MacroFLUXTM藥物溶出度與滲透速率測試系統示意圖

2.2 標準曲線的建立

2.2.1 對照品儲備液的配制 取鹽酸吡格列酮對照品適量，精密稱定，用DMSO制成每1 ml含吡格列酮8.1，1.0 mg兩種濃度的溶液，分別作為供體室對照品儲備液和受體室對照品儲備液。

2.2.2 供體室標準曲線的建立 胃模擬液（pH 1.6）：將光纖探頭置入200 ml胃模擬液（pH 1.6），每次加入90 μl的供體室對照品儲備液后測定，得每1 ml含吡格列酮3.7，7.3，11.0，14.7，18.3 μg的一系列溶液的紫外光譜，選取286～296 nm波長范圍，以吸光度二階導數為橫坐標，以濃度為縱坐標進行線性回歸，建立鹽酸吡格列酮制劑（規格：15 mg）胃模擬液（pH 1.6）中的標準曲線。同法操作，每次加入180 μl的供體室對照品儲備液后測定，建立鹽酸吡格列酮制劑（規格：30 mg）胃模擬液（pH 1.6）中的標準曲線。

空腹腸模擬液（pH 6.5）：將光纖探頭置入200 ml空腹腸模擬液（pH 6.5），每次加入50 μl的供體室對照品儲備液后測定，得每1 ml含吡格列酮2.0，4.1，6.1，8.2，10.2 μg的一系列溶液的紫外光譜，照胃模擬液（pH 1.6）下方法處理，建立鹽酸吡格列酮制劑（規格：15，30 mg）空腹腸模擬液（pH 6.5）中的標準曲線。

以上標準曲線的線性相關系數均大于0.9999，線性關系良好。

2.2.3 受體室標準曲線的建立 將光纖探頭置入50 ml ASB（pH 7.4）溶液中，每次加入50 μl的受體室對照品儲備液后測定，得每1 ml含吡格列酮1.0，2.1，3.1，4.1，5.2 μg的一系列溶液的紫外光譜，按照胃模擬液（pH 1.6）中的方法處理后建立受體室標準曲線。此標準曲線的線性相關系數大于0.9999，線性關系良好。

2.3 測定方法

采用圖1裝置，按溶出度與釋放度測定法（《中國藥典》2020年版四部通則0931第二法），溶出介質：開始以胃模擬液（pH 1.6）800 ml為溶出介質，30 min時加入混合溶液[空腹腸模擬液（10×）與磷酸鹽緩沖液等比混合]200 ml使成空腹腸模擬液（pH 6.5）；溫度：37.0 ℃；轉速：50 r/min；受體室（即滲透速率接收池）接收液：ASB緩沖液（pH 7.4）12 ml；微攪拌槳轉速：450 r/min；以50 μl胃腸道模擬脂質體溶液浸潤滲透速率接收池上的仿生膜（膜面積3.88 cm2），采集時間300 min，采樣間隔1 min。在240～400 nm內，用光纖探頭分別測定溶出杯和受體室中的吸光度，按公式（1）、（2）分別計算制劑的滲透速率J（FLUX）和總滲透量T（permeation amount）。采用雙側t檢驗的方法，按照下式（3）計算滲透速率和總滲透量幾何均值比的90%置信區間。

式中J為滲透速率，即藥物單位時間通過單位膜面積的量[μg/(min·cm2)]；為單位時間內受體室中藥物濃度變化速率[μg/(ml·min)]；V為受體室中接受液的體積（ml）；A為仿生膜膜面積（cm2，本次實驗為3.88 cm2）。

式中T為總滲透量（permeation amount），即藥物在測定時間通過仿生膜的總量（μg）；C為最終時間點接受液中的藥物濃度（μg/ml）；V為受體室中接受液的體積（ml）。

式中JT為受試制劑滲透速率的平均值，當計算總滲透量的90 %置信區間時，為受試制劑總滲透量的平均值；JR為參比制劑滲透速率的平均值，當計算總滲透量的90 %置信區間時，為參比制劑總滲透量的平均值；S為受試制劑滲透速率（或總滲透量）的標準偏差；n為樣本重復次數（本次實驗n=3）；C為換算系數，與重復次數具有相關性，n=3時，C=2.92。

受試制劑A規格為30 mg，選取的參比制劑規格為15 mg，在進行受試制劑A的生物等效性試驗時，參比制劑每溶出杯中投藥2片。進行受試制劑B、C等效性實驗時，受試制劑與參比制劑每溶出杯投藥1片。

2.4 生物等效性預測結果

受試制劑A在30 min時溶出杯中濃度可達30 μg/ml（見圖2 供體室），表明此時鹽酸吡格列酮溶出完全。在加入混合溶液后溶出介質由胃模擬液（pH 1.6）轉換為空腹腸模擬液（pH 6.5），溶出杯中鹽酸吡格列酮逐漸析出，濃度降低并維持約2.5 μg/ml（見圖2 供體室、圖3供體室）。受體室中前30 min鹽酸吡格列酮一直維持在極低濃度水平，表明藥物滲透較少，溶媒轉換至空腹腸模擬液（pH 6.5）后，受體室中吡格列酮濃度逐漸增加（見圖2受體室、圖3受體室）。30 min之前，鹽酸吡格列酮在胃模擬液（pH 1.6）中快速溶解，藥物濃度較高，但大部分呈解離狀態以離子形式存在，難以跨膜滲透；在空腹腸模擬液（pH 6.5）中雖溶解度降低，但多以分子形式存在易于跨膜。本實驗截取受體室120～170 min數據，根據受體室中測得的濃度，以時間對濃度進行線性回歸，各受試制劑與參比制劑的線性方程見表1，線性相關系數均大于0.995。以該時間段藥物濃度變化速率（即線性方程斜率）代入式（1）計算滲透速率，以300 min時測得的受體室接收液濃度（見表1）代入式（2）計算總滲透量，受試制劑A與參比制劑（投藥2片）計算結果（n=3）見表2，受試制劑A滲透速率和總滲透量幾何均值比的90 %置信區間在80.00 %～125.00 %之間，可初步預測其與參比制劑生物等效。鑒于受試制劑A已通過一致性評價，可證明此系統用于鹽酸吡格列酮制劑生物等效性初步預測的可行性及準確性。

表1 滲透速率線性方程及最終點受體室接受液濃度

圖2 受試制劑A溶出（供體室）與滲透（受體室）濃度變化圖

圖3 參比制劑（投藥2片）溶出（供體室）與滲透（受體室）濃度變化圖

表2 受試制劑A與參比制劑（投藥2片）滲透速率與總滲透量計算結果

對受試制劑B及受試制劑C進行生物等效性預測，計算結果（n=3）見表3。兩制劑的滲透速率和總滲透量幾何均值比的90 %置信區間均未落在80.00 %～125.00 %，可初步預測受試制劑B、C與參比制劑生物不等效。

圖4 受試制劑B溶出（供體室）與滲透（受體室）濃度變化圖

圖5 受試制劑C溶出（供體室）與滲透（受體室）濃度變化圖

圖6 參比制劑（投藥1片）溶出（供體室）與滲透（受體室）濃度變化圖

表3 受試制劑B、C與參比制劑（投藥1片）滲透速率與滲透總量計算結果

2.5 輔料對吡格列酮滲透性影響

將3批受試制劑的原料（稱取相當于其規格的重量）投入供體室中，通過與制劑滲透結果對比，以考察輔料對吡格列酮滲透性的影響。3批受試制劑的原料300 min時滲透濃度約20 μg/ml，受試制劑B和C 于300 min時滲透濃度約為11 μg/ml，而受試制劑A僅為6 μg/ml（見圖7），由此可見，3批受試制劑原料的滲透總量和滲透速率均遠高于其制劑。鑒于3批受試制劑在30 min內均能溶出完全，藥物的滲透性不再受其溶出的限制，故而輔料（種類、用量等）成為影響主成分滲透性的關鍵因素。

圖7 受試制劑A、B、C與其原料滲透性測定結果對比圖

3 討論

鹽酸吡格列酮是pH依賴型藥物，在胃模擬液（pH 1.6）中溶解度良好，溶媒轉換為空腹腸模擬液（pH 6.5）后因溶解度降低逐漸有沉淀析出（見圖8），輔料的用量、種類都可能成為影響沉淀粒子大小的因素。有文獻報道胃腸道中鹽酸吡格列酮析出后的粒徑影響藥物吸收，進而導致生物利用度差異[8]。提示在類似pH依賴型藥物的制劑處方篩選時因溶解度導致藥物析出沉淀的粒徑也值得關注。

圖8 受試制劑A、B在胃模擬液（pH 1.6）及空腹腸模擬液（pH 6.5）中溶解情況

對比不同規格鹽酸吡格列酮制劑的實驗數據發現，15 mg規格的滲透速率和總滲透量均高于30 mg規格。參比制劑投藥2片與投藥1片供體室、受體室中吡格列酮濃度變化對比情況見圖9。前30 min供體室介質為胃模擬液（pH 1.6），因吡格列酮能完全溶解，30 mg規格的供體室濃度遠高于15 mg規格。半小時后溶媒轉換為空腹腸模擬液（pH 6.5），因溶解度降低吡格列酮析出。由于30 mg規格過飽和濃度高，析出較15 mg規格快，自40 min開始供體室中濃度一直低于15 mg規格。通過對比原料（圖10）與制劑（圖9 供體室）在供體室的濃度變化發現，原料的過飽和析出較制劑緩慢。這說明吡格列酮在過飽和析出的過程中包裹輔料或者輔料的某些性質（用量、溶解性等）加速了這種析出。本預測系統是模擬基于濃度驅動的滲透行為，也就導致了30 mg規格的滲透低于15 mg規格。鑒于生物等效性研究以同等劑量的制劑相比較，所以此現象對本預測系統在生物等效性研究方面的應用影響較小。本實驗采用的溶出-人工仿生膜滲透性預測系統直觀地模擬了鹽酸吡格列酮體內溶出滲透過程，為鹽酸吡格列酮制劑的處方篩選和生物等效性初步預測提供了新思路和方法。

圖9 參比制劑投藥2片與投藥1片溶出（供體室）、滲透（受體室）濃度對比圖

圖10 原料30 mg與原料15 mg供體室濃度對比圖