正交試驗設計優選芪參還五膠囊的制備工藝

王世信，楊美娜，崔友祥，丁洪青

（1. 河北省滄州中西醫結合醫院 中藥藥學部，河北 滄州 061001；2. 河北省滄州中西醫結合醫院 腦病三科，河北 滄州 061001）

芪參還五膠囊是由經典方劑補陽還五湯發展而來，是中藥復方制劑，有清熱養陰、息風化痰、祛瘀通絡、補氣活血功效[1-2]。臨床常用于治療身疲乏力、頭痛半身不遂、胸痹、頭暈、中風、胸痛、胸悶、眩暈等[3]。傳統的湯劑攜帶困難，患者服用的順應性較差且易變質[4]，因此將湯劑制成膠囊劑更方便患者使用[5]。經過研究總結，黃芪、桃仁、紅花、當歸等藥物的有效成分在水中均有較好的溶解度，選擇水煎提取法；黃芪和赤芍為主藥，故選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷作為主要評價指標[6-7]。應用L9（34）正交實驗對芪參還五膠囊的提取工藝進行優化，為該制劑的制備選擇合理的提取工藝，為該制劑的大規模生產提供參考。

1 材料與儀器

黃芪、桃仁、紅花、當歸、赤芍、川芎、玄參、石決明、鉤藤、麥冬、連翹、地龍（甘肅安泰堂醫藥有限公司），經滄州市藥品檢驗所鑒定合格。芍藥苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（天津一方科技有限公司）。甲醇、乙腈均為色譜純，其余相關試劑為分析純。高效液相色譜儀（SmMADZU LC.15C）；色譜柱[依利特Hypersil ODS2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]；電子分析天平（AGl35）及各種常規儀器。

2 方法與結果

2.1 實驗設計

按照處方量，稱取黃芪、桃仁、紅花、當歸、赤芍、川芎、玄參、石決明、鉤藤、麥冬、連翹、地龍，共9份。選擇加水倍數、提取時間和提取次數作為主要考察因素，每個因素考察3個水平，進行正交試驗，以干膏得率作為主要的評價指標。考察因素見表1。

表1 提取條件正交試驗因素水平表

2.2 樣品測定方法學

2.2.1 高效液相法條件 色譜柱：依利特Hypersil ODS2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1 %磷酸水溶液（B）（21:79）；柱溫：30 ℃，流速：1 ml/min，波長230～260 nm；進樣量：10 μl，分析時間為80 min。

2.2.2 對照品溶液制備 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取芪參還五膠囊內容物約5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 ml，稱定質量，放置過夜，50 ℃超聲處理 1 h，放冷，濾過，濾液濃縮至干，用甲醇溶解并定容至5 ml，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按本品的處方比例參照最優制備工藝，配制不含赤芍、黃芪的陰性樣品，按2.2.3項方法制備陰性對照液。

2.2.5 線性關系考察 分別取對照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻配制成濃度分別為30，60，90，120，150，180 μg/ml溶液，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，按2.2.1項色譜條件，分別測定芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積，以對照品進樣量（x/μg）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，求得芍藥苷回歸方程，y=5×106x＋11086，r=0.9998，線性范圍為30～180 μg/ml；求得毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程，y=4.32×106x＋9823，r=0.9996，線性范圍為30～180 μg/ml。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按2.2.1項色譜條件，測定6次，記錄峰面積，計算芍藥苷的相對標準偏差為0.23 %，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的相對標準偏差為1.21 %，均符合要求。

2.2.7 穩定性試驗 精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μl，于0，2，4，8，12，24 h注入液相色譜儀，按2.2.1項色譜條件，記錄峰面積，計算芍藥苷的相對標準偏差為0.42 %，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的相對標準偏差為0.89 %，均符合要求。

2.2.8 重復性試驗 精密稱取芪參還五膠囊內容物，按供試品制備方法制備6份樣品供試品溶液，按2.2.1項色譜條件，計算峰面積。計算芍藥苷的相對標準偏差為1.05 %，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的相對標準偏差為0.84 %，均符合要求。

2.2.9 加樣回收試驗 精密稱取芪參還五膠囊內容物6份，精密加入一定量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷對照品溶液，制成供試品溶液。采用加樣回收率試驗，取同一批樣品設高、中、低3個濃度，每個濃度平行3份，各濃度水平加入對照品的量與所取供試品含量之比分別為1:1.5，1:1，1:0.5，測定峰面積。計算芍藥苷的回收率為98.49 %，RSD為0.52 %，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的回收率為101.16 %，RSD為0.79 %，均符合要求。

2.2.10 樣品的測定 將各實驗收集的溶液進行水浴蒸干，并將殘渣置于105 ℃烘箱干燥。精密稱取正交實驗各實驗所得到的干膏重量，計算干膏率；并精密稱取各樣品適量，參考2.2.3項的方法對樣品進行處理，過0.22 μm微孔濾膜，取10 μl濾液進樣分析，結果見表2。對所得結果進行方差分析，結果見表3。

表2 正交實驗表

表3 兩藥含量方差分析

當以毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷作為主要評價指標時，通過極差分析，對毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷含量的主要影響因素為提取次數，其次為提取時間和加水量；方差分析結果表明，提取次數是對提取工藝影響最大的影響因素；通過對數值大小進行直觀比較，A2B3C2為最佳提取工藝。

當以干膏率作為主要評價指標時，通過極差分析，主要影響因素為提取次數，其次為提取時間和加水量；方差分析表明，提取次數是影響提取工藝的主要因素，通過對干膏率進行數據直觀分析，最佳提取工藝為A3B3C2。

對結果進行綜合考慮，為了節約工時和成本，并達到最大的有效成分提取率和干膏率，最終選擇最佳工藝為A2B3C3，即加入藥材10倍的水，每次提取2 h，共提取3次。

2.3 實驗驗證

按照處方量稱取藥物3份，按照選取的最佳提取工藝進行提取，3次獲得的干膏率分別為44.12 %，45.39 %和44.29 %，芍藥苷的含量分別為185.32，178.29和182.31 μg/g，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量分別為163.93，158.28和159.37 μg/g，RSD值分別為1.54 %，1.93 %和1.87 %（n=3）。結果表明，應用正交實驗對芪參還五膠囊的制備工藝進行篩選，得到干膏率、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷含量較高的制備方法。該工藝穩定可行、科學合理可以用于大生產。

3 討論

補陽還五湯出自清代醫家王清任之書寫的《醫林改錯》，處方主要由四兩生黃芪、二錢當歸尾、一錢半赤芍、一錢地龍、一錢川芎、一錢紅花和一錢桃仁組成[8]，是體現益氣活血治法的代表藥方，常用于治療中風后遺癥[9-10]。本處方臨床療效較好[11]，主要用于治療中風，患者的常見證狀為舌暗苔白脈緩、遺尿不禁、小便頻數、口角流涎、語言謇澀、口眼歪斜、肢體麻木和半身不遂[12-13]。具有補氣、通絡、活血的功效，主要通過大補元氣，輔助以活血通絡。

芪參還五膠囊[14]藥物成分的固體顆粒形式，大大方便儲存和運輸；顆粒制劑藥物含水量少，藥物不易腐敗變質，增加了藥物的儲存時間，患者可一次獲得多日劑量；膠囊形式也較好地提升了患者的順應性。

本文對本處方進行HPLC方法驗證，結果表明，色譜峰形較好，分離度足夠，且線性、精密度、穩定性、加樣回收率等項目均符合要求，表明此法能對毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷進行很好的定性和定量分析。對制備芪參還五膠囊的工藝進行優化，結果表明，該提取工藝所得產品的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷含量較高，所得干膏的量較多，且實驗重復性較好，為芪參還五膠囊的進一步研究提供了技術支持。