功能矯形對安氏Ⅱ類錯牙合模型大鼠髁突軟骨生長發育及VEGF表達的影響

[摘要]目的：探討安氏Ⅱ類錯牙合模型大鼠在接受功能矯形后其髁突軟骨生長發育及VEGF表達的情況。方法：安氏Ⅱ類錯牙合模型大鼠30只，隨機分為實驗組（n=15，佩戴咬合前導矯治器，連續佩戴30 d），對照組（n=15，不佩戴咬合前導矯治器）。處死大鼠，觀察兩組大鼠雙側顳下頜關節髁突軟骨前、中、后部生長發育情況、軟組織形態、VEGF陽性表達、VEGF蛋白表達。結果：建模前兩組髁突軟骨厚度比較，差異無統計學意義（P>0.05），建模后實驗組各部厚度明顯較對照組更厚，差異具有統計學意義（均P<0.05）。實驗組軟骨增殖層細胞數量較對照組有所上升，細胞核有明顯變大，成熟層細胞和細胞間質出現增長，肥大層細胞數量、分泌量與對照組相比呈增長趨勢，軟骨中部、后部纖維層變化不明顯。VEGF在細胞漿和細胞膜中表達為棕黃色，兩組后部陽性細胞數均高于中部，中部陽性細胞數均高于前部，其中，對照組髁突軟骨前部、中部、后部VEGF蛋白陽性數均低于實驗組。兩組髁突軟骨VEGF蛋白表達在前、中、后部呈階梯狀增長，各部對比差異均有統計學意義（均P<0.05）。結論：功能矯形可促進安氏Ⅱ類錯牙合大鼠下頜髁突軟骨局部生長，提高VEGF表達。

[關鍵詞]血管內皮生長因子;安氏Ⅱ類錯牙合;功能矯形;髁突軟骨;SD大鼠

[中圖分類號]R783.5? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）03-0103-04

Effects of Functional Orthopedics on the Growth and Development of Condylar Cartilage and the Expression of VEGF in Angel's Class Ⅱ Malocclusion Model Rats

ZHENG Xinyu

（Department of Stomatology，Heze Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shandong Province，Heze 274000，Shandong，China）

Abstract： Objective To investigate the growth and development of condylar cartilage and the expression of VEGF in Angel's Class Ⅱ malocclusion model rats after functional orthopedics. Methods Thirty Angle Class Ⅱ malocclusion model rats were randomly divided into experimental group （with occlusal guide appliance for 30 days） and control group （without occlusal guide appliance）. The rats were sacrificed， and the growth and development of the anterior， middle and posterior parts of the bilateral temporomandibular joint condylar cartilage， soft tissue morphology， VEGF positive expression and VEGF protein expression were observed in the two groups of rats. Results? Before modeling，there was no significant difference in the thickness of condylar cartilage between the two groups （P>0.05）. After modeling， the thickness of each part in the experimental group was significantly thicker than that in the control group （all P<0.05）. Compared with the control group， the number of cells in the proliferative layer of the cartilage in the experimental group increased， the nuclei became larger， the mature layer cells and intercellular substance increased， and the number and secretion of the hypertrophic layer cells increased compared with the control group. The fibrous layer did not change significantly. The expression of VEGF in cytoplasm and cell membrane was brownish yellow. The number of positive cells in the rear of the two groups was higher than that in the middle， and the number of positive cells in the middle was higher than that in the front. Among them， the positive number of VEGF protein in the front， middle and rear of condylar cartilage in the control group was lower than that in the experimental group. The expression of VEGF protein in the anterior， middle and posterior parts of the condylar cartilage in the two groups increased in a step-like manner， and the differences in each part were statistically significant （all P<0.05）. Conclusion Functional orthopedics can promote the local growth of mandibular condyle cartilage and increase the expression of VEGF in Angle Class Ⅱ malocclusion rats.

Key words： vascular endothelial growth factor; Angle Class Ⅱ malformation; functional orthopedics; articular cartilage; SD rats

安氏Ⅱ類錯牙合畸形是我國常見的一種錯牙合畸形，嚴重的錯牙合畸形表現為牙齒排列異常，或者骨骼異常改變[1]。功能性矯治器能幫助下頜前伸，促進髁突軟骨的成長和重建，使下頜位置后縮得以糾正，下頜發育不足得到改善，在矯正兒童生長發育期間牙齒畸形效果較好[2]。近年來，大量臨床研究發現固定類功能矯治器也適用于成人，治療效果也很好，大多數學者認為下頜骨功能整形擴張可以促進髁突軟骨的成長和代謝，延長下頜骨的長度，達到Ⅱ類錯牙合矯正的目的[3-4]。血管內皮生長因子（VEGF）作為重要的血管新生因子，可通過旁分泌產生作用，刺激血管內皮細胞的有絲分裂，提高血管內皮細胞的滲透性，促進血管新生，形成調節骨[5]。此外，VEGF涉及胚胎發生中的血管新生的過程以及炎癥及創傷的治愈過程，近年來，在長骨中也有VEGF的發現，軟骨細胞及成骨細胞中也有VEGF表達，長骨VEGF在軟骨內骨形成中發揮重要作用[6]。有研究發現，在生長中的大鼠髁突和顳骨中檢測出VEGF表達，下頜骨髁突中的軟骨細胞發現了VEGF，可刺激血管形成[7]。由此本文通過建立安氏Ⅱ類錯牙合模型大鼠，探討功能矯形對安氏Ⅱ類錯牙合模型大鼠髁突軟骨生長發育及VEGF的表達的作用。

1? 材料和方法

1.1 模型建立：自廣東省醫學實驗動物中心，購買9周齡的SD大鼠30只，體重為（239.91±21.86）g。30只大鼠采用速眠新Ⅱ麻醉（腹腔注射0.3～0.8 ml/kg），利用粘接材料將斜面導板粘固于上切牙，調整下頜切牙與斜面導板的接觸面，斜面導板與上頜平面呈約25°角，以保證下頜不發生偏斜。通過固位鉤將鏈狀橡皮圈經鼻上頜復合體與防護頸圈連接，使得斜面導板獲得穩定的固位，防護頸圈能夠有效地防止大鼠前爪對裝置的破壞及對面部組織的傷害。見圖1。

1.2 分組：將大鼠隨機分為實驗組（佩戴咬合前導矯治器）15只，持續佩戴30 d;對照組（不佩戴咬合前導矯治器）15只，建模結束所有動物自由進食飲水。

1.3 觀察兩組髁突軟骨前、中、后部的4個指標：①生長發育情況;②組織形態;③VEGF陽性表達情況;④VEGF蛋白表達情況。

1.3.1 光鏡觀察軟骨生長發育情況：實驗組、對照組動物飼養30 d后進行深度麻醉處死，暴露大鼠顴弓，取出雙側顳下頜關節，對關節盤前帶最厚處、中帶最厚處、后帶最厚處進行厚度測量，采用Olympus CX31型光學顯微鏡，在40倍鏡下觀察，并使用Pixera PVC100C系統采集圖片，電子測量尺測定，對實驗組、對照組的髁突軟骨厚度進行記錄。

1.3.2 HE染色觀察軟骨組織形態：將取出的雙側顳下頜關節進行甲醛溶液固定，乙醇溶液進行脫水，石蠟包埋后取出髁突縱向切片5 μm，用山羊血清進行封閉處理，蘇木精和伊紅染色液復染分別為6～8 min和10 s，于顯微鏡下觀察雙側顳下頜組織形態。

1.3.3 免疫組化染色觀察VEGF陽性表達情況：將取出的雙側顳下頜關節進行甲醛溶液固定，石蠟包埋后取出髁突縱向切片5 μm，乙醇溶液實施脫水，滴加抗原消化液、修復液，山羊血清實施封閉，按1∶50比例加入一抗及二抗，用DAB實施染色，蒸餾水終染，再蘇木素襯染，脫水后可封片，于顯微鏡下觀察到髁突軟骨VEGF表達為棕（褐）色即為陽性。VEGF陽性表達率檢測方法：組織切片收集后，隨機在髁突軟骨前部、中部、后部各抽取切片，運用光學顯微鏡對髁突軟骨前、中、后部進行觀測，每部分選擇連續3個64px×64px大小的區域，計數各區域VEGF棕色深染的陽性細胞數，最終得出其陽性表達率。

1.3.4 Western Blot檢測VEGF蛋白表達：石蠟包埋的髁突軟骨組織，用PBS溶液洗滌三次，切碎處理加入1ml裂解液，測定組織中的蛋白質濃度，用100V的SDS-PAGE電泳，采用Bradford法實施定量，電泳后收集產物，轉至PVDF膜上，10%山羊血清封閉0.5 h。一抗過夜孵育4℃條件下，二抗室溫下孵育1 h，洗膜在室溫下進行，次數3次，β-actin作內參，用Quantity one 4.0軟件分析VEGF蛋白表達。

1.4 統計學分析：用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計和分析，所有數據采用xˉ±s表示，兩組對比行t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 兩組髁突軟骨生長發育情況：建模前兩組髁突軟骨各部厚度對比，差異無統計學意義（P>0.05）;建模后實驗組髁突軟骨各部厚度均較對照組更厚，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 兩組髁突軟骨組織形態對比：實驗組軟骨前、中、后部增殖層細胞數量較對照組均有所上升，細胞核有明顯變大，成熟層細胞和細胞間質出現增長，肥大層細胞數量、分泌量與對照組相比呈增長趨勢，軟骨中部、后部纖維層變化不明顯。見圖2。

2.3 免疫組化染色：VEGF在細胞漿和細胞膜中表達為棕黃色，兩組后部陽性表達率均高于中部，中部陽性表達率均高于前部，其中，對照組髁突軟骨前部、中部、后部VEGF蛋白陽性表達率均低于實驗組。見圖3。

2.4 兩組大鼠髁突軟骨前部、中部、后部的VEGF蛋白表達變化：兩組髁突軟骨前部VEGF表達對比，差異無統計學意義（P>0.05）;實驗組大鼠髁突軟骨中部和后部VEGF表達均較對照組顯著升高，差異具有統計學意義（t=3.675，6.057，均P<0.05）。兩組髁突軟骨前部VEGF蛋白表達最低，中部蛋白表達其次，后部蛋白表達最高，各部對比差異均有統計學意義（均P<0.05）。見圖4。

3? 討論

誘導下頜前伸的功能性矯治器可用于矯正Ⅱ類錯牙合[8]。骨髁突關節的髁突軟骨和關節盤重建，反映外力對髁突產生的各種影響[9]。髁突軟骨受到外力刺激，影響增殖細胞最終分化為成熟軟骨細胞[10]。成熟的軟骨細胞層連續分泌細胞外基質，在這個過程中逐漸分化成肥大層軟骨細胞，與軟骨下相鄰的肥大層骨骼形成活化，軟骨細胞鈣化變成下層的骨組織。突出的組織持續成長，并且成年后也維持一定的重建能力[11]。而VEGF是下頜骨軟骨的成長及發育的重要調節因子，VEGF在軟骨和骨的接合部對血管內皮細胞起作用，促進血管形成，并誘導小血管向軟骨肥大層生長，提供對髁突軟骨成長和發育必要的營養物質[12]。

有研究證實，軟骨內骨化的過程與軟骨所受外力的變化密切相關，下顎前伸使下頜骨的位置發生變化，髁突軟骨局部承受力發生改變，誘導軟骨組織產生一系列生物學反應。有研究證實，下顎前伸、髁突變位后，促進鈣化軟骨中內骨化形成，導致肥大軟骨細胞也呈鈣化趨勢且形成速度較快，細胞鈣化成骨組織，因此髁突組織局部發育、生長加快[13-14]。筆者研究發現，功能矯形的大鼠髁突局部生長加快，軟骨較對照組厚，軟骨增殖層細胞數量較對照組有所上升，細胞核有明顯變大，成熟層細胞和細胞間質出現增長，肥大層細胞數量、分泌量均呈增長趨勢，軟骨中部、后部纖維層變化不明顯。結果提示功能矯形對髁突軟骨生長發育具有明顯的改善作用。這與之前的報道相符。

VEGF是軟骨細胞凋亡、破骨細胞功能、細胞外基質變化、血管新生及骨骼形成的重要調整因子。VEGF可以通過調節血管形成來參與骨骼形成及骨組織治愈的過程，內因性VEGF可以促進血管形成、骨痂形成及鈣化，伴隨骨骼形成及骨膜下骨形成加速骨達到愈合的效果。有研究證實，小鼠VEGF基因的敲除后，阻礙血管侵入軟骨，說明VEGF在軟骨血管化的初期階段及后期階段發揮重要作用，并在關節軟骨中發現大量的細胞死亡，說明VEGF表達水平與軟骨的生長十分重要[15]。本研究中，筆者觀察到軟骨中，VEGF的陽性表達及蛋白表達從前部到后部均遞增，且功能矯形后的大鼠相對于對照組，VEGF在軟骨不同部位的表達均顯著升高。以上結果提示，功能矯形有助于提高大鼠軟骨VEGF表達，以促進軟骨的形成。

綜上所述，功能矯形可促進安氏Ⅱ類錯牙合大鼠下頜髁突軟骨局部生長，提高VEGF表達。

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[收稿日期]2020-11-06

本文引用格式：鄭新宇.功能矯形對安氏Ⅱ類錯牙合模型大鼠髁突軟骨生長發育及VEGF表達的影響[J].中國美容醫學，2022，31（3）：103-106.