MsrA在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義

張桂安，羅勇，董衛(wèi)民，陳清標(biāo)，鐘惟德

（1.華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510180；2.佛山市第二人民醫(yī)院泌尿外科，廣東佛山528000；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510799）

腎細(xì)胞癌是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，其中70%以上的腎細(xì)胞癌都是腎透明細(xì)胞癌[1]。當(dāng)前腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢，然而腎透明細(xì)胞癌患者的臨床表現(xiàn)通常并不典型，通過影像學(xué)和病理學(xué)確診時，多數(shù)患者已進(jìn)入疾病晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后并不理想[2?3]。因此，臨床醫(yī)師通過尋找到特異性高和敏感度強(qiáng)的生物標(biāo)志物來診斷腎透明細(xì)胞癌，從而為患者提供最佳的個體化治療方案，既可以避免患者高昂的醫(yī)療費(fèi)用，又可以客觀評估腫瘤的預(yù)后。

甲硫氨酸亞砜還原酶A（methionine sulfoxide reductase A，MsrA）是與抗氧化應(yīng)激和維持蛋白穩(wěn)定關(guān)系密切的一種抗氧化酶。研究表明MsrA 的過表達(dá)增強(qiáng)了對氧化應(yīng)激的抵抗力，而MsrA空突變體對氧化應(yīng)激表現(xiàn)得更敏感，并且氧化損傷是衰老的關(guān)鍵因素，MsrA能夠維持蛋白穩(wěn)定延緩衰老[4]。MsrA可能通過調(diào)控靶蛋白的功能和表達(dá)，參與活性氧介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。MsrA在結(jié)直腸癌、胃癌和肝癌等多種腫瘤中表達(dá)更低，能下調(diào)腫瘤活性[5?7]。但MsrA在腎透明細(xì)胞癌中的作用還沒有相關(guān)文章報道。本課題擬研究TCGA 數(shù)據(jù)庫和收集臨床樣本中的MsrA在腎透明細(xì)胞癌及其癌旁組織中的表達(dá)差異，通過分析MsrA 與臨床數(shù)據(jù)特征和臨床預(yù)后之間的關(guān)系，最后采用列線圖來構(gòu)建預(yù)測腎透明細(xì)胞癌患者的生存預(yù)后模型，從而為個體化治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究收集了佛山市第二人民醫(yī)院5對腎透明細(xì)胞癌和癌旁組織標(biāo)本，所有病例均為接受腎癌切除術(shù)，術(shù)前未行放射治療或化學(xué)治療。樣本都由病理科醫(yī)師通過HE染色明確診斷。

1.2 數(shù)據(jù)下載

從TIMER 數(shù)據(jù)庫（http：//timer.cistrome.org/）下載MsrA 在泛癌中表達(dá)情況。從GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer?pku.cn/index.html）中下載得到MsrA 在腎透明細(xì)胞癌及其對照癌旁組織的差異表達(dá)情況。最后從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載TCGA?KIRC 基因表達(dá)及其臨床信息數(shù)據(jù)，在基因表達(dá)數(shù)據(jù)集中提取出MsrA mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)及其相對應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)特征資料，包括年齡、性別、分級、臨床分期、生存時間和生存狀態(tài)。同時將表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)資料進(jìn)行匹配，排除表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床信息不全的樣本，最終得到526 例腎透明細(xì)胞癌組織和72 例癌旁組織進(jìn)行后續(xù)的分析。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

根據(jù)邁新試劑盒（貨號：KIT?9730）說明采用免疫組織化學(xué)染色檢測MsrA 在腎組織標(biāo)本中的蛋白表達(dá)水平。60 ℃烘烤切片1 h后在二甲苯和不同酒精濃度梯度中進(jìn)行脫蠟，之后使用枸櫞酸抗原修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)。過氧化酶阻斷溶液室溫孵育15 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，再以非免疫性動物血清室溫封閉30 min。一抗MsrA（1∶200，武漢Proteintech，貨號：14547?1?AP）孵育過夜后予生物素標(biāo)記的第二抗體室溫孵育20 min，隨后孵育鏈霉菌抗生物素?過氧化物酶溶液。15 min 后進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。免疫組化評分由2 位病理科醫(yī)師獨(dú)立確定，評分方法：以鏡下陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度評分。計(jì)算陽性染色細(xì)胞百分率，分為0（0～5%）、1（6%～25%）、2（26%～50%）、3（51%～75%）、4（76%～100%）。染色強(qiáng)度分為0（陰性）、1（弱）、2（中等）、3（強(qiáng)）。免疫組化評分由染色百分率與染色強(qiáng)度評分相乘確定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R 4.1.1 和GraphPad Prism8 分析處理數(shù)據(jù)和繪制作圖。配對樣本中的表達(dá)量采用配對t檢驗(yàn)，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和Kruskal?Wallis檢驗(yàn)分別用于比較兩組間和兩組以上之間的非配對數(shù)據(jù)。生存曲線采用Kaplan?Meier 檢驗(yàn)繪制，森林圖用于繪制單因素和多因素Cox 回歸分析，列線圖用于預(yù)測患者的生存預(yù)后。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MsrA 在腎透明細(xì)胞癌和癌旁組織中的表達(dá)情況

從TIMER 數(shù)據(jù)庫中下載MsrA 表達(dá)的泛癌數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MsrA 在腎透明細(xì)胞癌組織中的mRNA 表達(dá)水平低于癌旁組織（見圖1A），這一結(jié)果在GEPIA數(shù)據(jù)庫中得到了驗(yàn)證（P＜0.05，見圖1B）。結(jié)合TCGA 數(shù)據(jù)庫，在72 對腎透明細(xì)胞癌配對樣本中，發(fā)現(xiàn)癌旁組織的表達(dá)高于腫瘤組織（P＜0.01，見圖1C）。在免疫組織化學(xué)染色中，MsrA 陽性染色為棕黃色，在腎癌旁和腎透明細(xì)胞癌組織中主要表達(dá)在腎小管上皮的胞質(zhì)內(nèi)（見圖1D，E），兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖1F）。

圖1 MsrA在腎透明細(xì)胞癌和癌旁組織中的表達(dá)差異Figure 1 Differential expression of MsrA in renal clear cell carcinoma and adjacent tissues

2.2 MsrA 表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床數(shù)據(jù)特征的關(guān)系

在TCGA 數(shù)據(jù)庫中，以MsrA mRNA 表達(dá)量中位數(shù)將MsrA 分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，熱圖結(jié)果顯示性別、臨床分期的T分期和生存狀態(tài)在MsrA高低兩組中存在明顯差異（見圖2A）。為研究MsrA mRNA 表達(dá)量在不同臨床數(shù)據(jù)特征條件下是否存在差異，本研究發(fā)現(xiàn)MsrA 的mRNA 表達(dá)量在女性中表達(dá)更高，隨著分級和臨床分期的增加，MsrA mRNA 表達(dá)量反而下降，而且在存活患者中的表達(dá)量更高（見圖2B）。

圖2 MsrA mRNA表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床數(shù)據(jù)特征的關(guān)系Figure 2 Relationship between MsrA mRNA expression and clinical data characteristics of renal clear cell carcinoma

2.3 MsrA表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系

利用Kaplan?Meier 生存曲線分析發(fā)現(xiàn)高M(jìn)srA mRNA 表達(dá)組的腎透明細(xì)胞癌患者總體生存率更高（P＜0.001，見圖3A）。單因素和多因素Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)MsrA mRNA 表達(dá)水平、年齡、分級和臨床分期均是腎透明細(xì)胞癌患者總體生存率的影響因素，MsrA mRNA 高表達(dá)是腎透明細(xì)胞癌患者獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)（見圖3B、C）。

圖3 MsrA表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系Figure 3 Relationship between MsrA expression and prognosis of patients with renal clear cell carcinoma

2.4 列線圖預(yù)測模型構(gòu)建

將多因素Cox回歸有意義的臨床變量納入預(yù)測模型來繪制列線圖。單個臨床變量的不同賦值對應(yīng)不同得分，將所有臨床變量得分相加為總分，根據(jù)對應(yīng)的總分即可找出該患者1、2 和3 年生存率（見圖4A）。本研究同時構(gòu)建了列線圖預(yù)后模型校準(zhǔn)圖（見圖4B），結(jié)果顯示該模型實(shí)際觀測的1、2、3年總體生存與參考曲線較為接近，表明該模型預(yù)測性能較強(qiáng)。

圖4 列線圖預(yù)測模型Figure 4 Nomogram prediction model

3 討論

腎透明細(xì)胞癌是腎細(xì)胞癌中最常見的病理類型，而且也是發(fā)病率、死亡率、轉(zhuǎn)移率最高的組織類型。雖然手術(shù)治療和分子靶向藥物治療提高了腎透明細(xì)胞癌的生存預(yù)后，但目前仍缺乏對腎透明細(xì)胞癌患者診斷和預(yù)后的評估指標(biāo)，尋找特異性高和敏感度強(qiáng)的診斷生物標(biāo)志物，將對腎透明細(xì)胞癌患者針對性的個體化治療治療和預(yù)測預(yù)后有重要意義[8?9]。

MsrA 是細(xì)胞內(nèi)能清除活性氧的一種重要抗氧化酶，該基因位于8p22?8p23 區(qū)帶。在多種腫瘤發(fā)現(xiàn)MsrA基因高頻缺失，該基因失活將導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的活性氧清除障礙，而活性氧清除障礙在幾乎所有腫瘤中都能觀察到，并且活性氧在腫瘤的發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)過程中起著關(guān)鍵作用[10]。胃黏膜感染幽門螺旋桿菌后會刺激中性粒細(xì)胞過度釋放活性氧而出現(xiàn)持續(xù)的氧化應(yīng)激和慢性免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致DNA 損傷進(jìn)展成胃癌[11]。MsrA 表達(dá)下降會使活性氧水平升高，PTEN下調(diào)，VEGF上調(diào)，以及磷酸肌醇3?激酶通路的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)降解的增加，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)靶向腫瘤細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞線粒體內(nèi)的過氧化氫酶可抑制活性氧驅(qū)動的腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[12]。因此增加線粒體的抗氧化能力可成為抗腫瘤治療的一個合理方法。MsrA 在防止氧化應(yīng)激和增強(qiáng)氧化應(yīng)激的抵抗力方面具有關(guān)鍵作用，保護(hù)細(xì)胞免受傷害。有研究表明，MsrA 可以保護(hù)腎臟細(xì)胞免受抗腫瘤化療藥物順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、線粒體損傷和細(xì)胞凋亡的影響[13]。此外，MsrA可以通過減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)從而保護(hù)腎臟免受缺血?再灌注損傷[14]。腎透明細(xì)胞癌的生長依賴于外源性的谷氨酰胺并展現(xiàn)出谷氨酰胺代謝重編程，而谷氨酰胺代謝途徑能夠提高腎透明細(xì)胞癌的抗氧化能力，從而抑制氧化應(yīng)激[15]。在體外的動物實(shí)驗(yàn)表明，與鄰近的正常和對側(cè)的正常腎組織相比，腎透明細(xì)胞癌異種移植腫瘤表現(xiàn)出更高的氧化應(yīng)激水平[16]。因此，MsrA 可能通過影響氧化應(yīng)激從而影響腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程，這可能成為一種治療腎透明細(xì)胞癌的新靶點(diǎn)。

本研究中，與腎癌旁組織相比，MsrA 在腎透明細(xì)胞癌組織的表達(dá)水平較低，這表明MsrA 可能通過下調(diào)抗氧化酶的活性，使活性氧水平上升，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外MsrA 表達(dá)水平在男性較低，且隨著分級和臨床分期的增加反而下降，這說明MsrA 可能作為抑癌因子，其表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的惡性程度呈負(fù)相關(guān)。通過生存曲線發(fā)現(xiàn)MsrA高表達(dá)組患者的生存率更高，單因素和多因素Cox回歸分析也表明MsrA mRNA 高表達(dá)是腎透明細(xì)胞癌患者良好預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。本研究也構(gòu)建一個新的預(yù)測模型并且具有相對較強(qiáng)的預(yù)測性能，通過列線圖來預(yù)測腎透明細(xì)胞癌患者的生存預(yù)后以提供更好的個性化治療方案。

綜上所述，MsrA 在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)減少，與正常腎臟組織的表達(dá)水平有顯著差異。MsrA表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌的臨床病理特征和預(yù)后有關(guān)，MsrA 低表達(dá)是腎透明細(xì)胞癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素。對MsrA 的研究為今后腎透明細(xì)胞癌的腫瘤分子靶向藥物的研發(fā)和科學(xué)治療起到積極的推動作用。