健脾解毒湯聯合5?氟尿嘧啶對胃癌大鼠p53/Hippo 信號通路的調節作用

王存吉，余芳，胡亞

（湖南中醫藥高等?？茖W校附屬第一醫院腫瘤一科，湖南株洲412000）

胃癌是全世界發病率和死亡率均較高的消化道腫瘤疾病之一。在我國胃癌的發病率位居所有腫瘤疾病的第4 位，死亡率居第2 位[1]。由于胃癌早期的臨床表現不明顯，發病隱匿，多數患者就診時已處于胃癌中晚期。目前臨床用于治療胃癌的藥物有限，5?FU 是治療胃癌的常用藥物之一，但在臨床應用中表現出有效率低、復發率高等缺點[2]，所以對于胃癌治療藥物的探討仍是臨床工作重點。p53/Hippo通路是與腫瘤疾病相關的信號通路，研究發現其在胃癌的發生發展中起重要作用[3]。健脾解毒湯是以中醫理論為指導的中藥成方制劑，近年來研究發現其在胃癌的治療中能夠增強化療敏感性并減少不良反應的發生[4?5]。本實驗通過研究健脾解毒湯聯合5?FU對胃癌大鼠p53/Hippo信號通路的調節作用，旨在為健脾解毒湯的藥理作用研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

健脾解毒湯藥材飲片薏苡仁30 g（批號190522），野葡萄藤30 g（批號181228），石見穿30 g（批號191012），生黃芪15 g（批號191108），豬苓15 g（批號190809），八月札15 g（批號191008），白術12 g（批號190705），購自北京同仁堂有限公司，藥材飲片經歐陽榮主任藥師鑒定為正品。將藥材飲品置于1 500 mL蒸餾水中煎煮2次，過濾并合并濾液，蒸發濃縮，制成每毫升含2 g 生藥的制劑；5?FU（天津金耀藥業有限公司，批號201906201，規格10 mL：0.25 g）；大鼠MTL ELISA 試劑盒（武漢益普生物科技有限公司，批號CK?E30376）；大鼠PGI ELISA 試劑盒（上海梵態生物科技有限公司，批號FT?D24774）；大鼠GAS ELISA 試劑盒（滁州仕諾達生物科技有限公司，批號SND?R747）；大鼠TNF?αELISA 試劑盒、cDNA 合成試劑盒、組織裂解液、ECL 化學發光液、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（碧云天生物科技有限公司，批號分別為PT516、D7170S、P0013B、P0018S、A0208）；大鼠Bax及Bcl?2 ELISA 試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司，批號CSB?EL002573RA?1、CSB?E08854r?1）；p53、YAP1 及GAPDH 兔多克隆抗體（賽默飛世爾科技有限公司，批號分別為PA5?88098、PA5?17609、PA1?16777）；Trizol 總RNA 抽提試劑、二喹啉甲酸（BCA）蛋白測定試劑盒、HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為15596026、PC0020、G1120）；PCR 引物設計及合成由賽默飛世爾科技有限公司完成。

1.2 儀器與設備

H1850R 臺式高速冷凍離心機（上海賽弗生物科技有限公司）；CKX41?F32FL熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；YD?202石蠟切片機（上海文樂生物科技有限公司）；EG1150石蠟包埋機（德國Leica公司）；iQ5TM PCR 檢測系統（美國Bio?Rad 公司）；E?Gel Imager 凝膠成像儀（賽默飛世爾科技有限公司）；MY?10 組織勻漿器（上海研卉生物科技有限公司）。

1.3 實驗動物

SD大鼠60只，雄性，SPF級，6周齡，180～200 g，購自于湖南省實驗動物中心，生產許可證號SCXK（湘）2016?0001，飼養于本院動物房，溫度22～25 ℃，相對濕度40%～70%，自由飲食，自然光照，實驗動物倫理批號（202010170356）。

1.4 造模、分組

60 只大鼠隨機分為空白對照組12 只及造模組48 只。參照文獻[6]方法，造模組大鼠自由飲用200 μg/mL 的N?甲基?N?硝基?N?亞硝基胍（MNNG）溶液，連續16 周，空白對照組喂養自來水。造模結束后，隨機取3只大鼠進行胃組織病理學檢查，以大鼠胃組織出現明顯腸上皮化生或異型增生病變視為造模成功，造模組大鼠隨機分為胃癌模型組、健脾解毒湯組、5?FU組、健脾解毒湯聯合5?FU組。

1.5 給藥

參照臨床給藥劑量[4?5]的6.3 倍折算，健脾解毒湯組按照13 g/kg（以生藥含量計）灌胃給予大鼠健脾解毒湯，1 次/d，5?FU 組參照文獻[7]方法，按照17.5 mg/kg 隔日腹腔注射1 次5?FU，健脾解毒湯聯合5?FU 組同時給予大鼠健脾解毒湯及5?FU，連續給藥10 周[6]，空白對照組及胃癌模型組灌胃給予生理鹽水，末次給藥結束24 h后進行后續實驗。

1.6 大鼠血清MTL、PGI及GAS測定

大鼠麻醉后取腹主動脈血，4 ℃條件下靜置1 h后，3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，分離上清液，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書的方法，檢測血清MTL、PGI及GAS水平。

1.7 大鼠胃組織TNF?α、Bax及Bcl?2測定

斷頭法處死大鼠后，分離胃組織，置于4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖液中，在組織勻漿器中研磨勻漿，4 ℃條件下，8 000 r/min，離心10 min，取上清液，使用ELISA試劑盒測定大鼠胃組織TNF-α、Bax及Bcl?2水平。

1.8 胃組織病理檢查

斷頭法處死大鼠后，收集胃組織，用4%（φ）中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，制備5 μm 石蠟切片。隨后，石蠟切片在二甲苯中脫蠟，經梯度乙醇脫水后，常規HE 染色，脫水、透明、封片后，置于顯微鏡下盲法進行胃組織病理變化檢查。

1.9 大鼠胃組織p53及YAP1 mRNA水平測定

斷頭法處死大鼠后用Trizol 試劑從胃組織中提取總RNA，使用cDNA 合成試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA，根據引物序列，采用RT?qPCR檢測胃組織p53 及YAP1 mRNA 水平，結果以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。用于RT?qPC反應的基因引物序列為，

GAPDH：正向引物：5′?ATACTACGCCCAGAG?GATGA?3′，反向引物：5′?GAAGAAGAGGAGGTG?GAAGAAC?3′；

p53：正向引物：5′?TCCAACGTGCTTTACTCT?CTATC?3′，反向引物：5′?TGTCAGTTACCAGCGT?CAAATA?3′；

YAP1：正向引物：5′?CTAGGCATCGAGGTTAC?ATT?3′，反向引物：5′?CTTGGCTGAGTACCAC?TCT?TATC?3′。

1.10 大鼠胃組織p53及YAP1蛋白水平測定

取大鼠胃組織，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑的組織裂解液，研磨勻漿，從組織標本中提取總蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白總濃度，取相當于50 μg 蛋白的組織勻漿液在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中進行電泳分離，然后將蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜上，在牛血清白蛋白中室溫封閉1 h，分別經p53、YAP1 及GAPDH 抗體（1∶500 稀釋）在4 ℃條件下孵育過夜，使用含吐溫?20的Tris?Buffer 洗滌3 次，10 min/次，再經辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶1 000 稀釋）室溫孵育1 h，再次 用含 吐溫?20 的Tris?Buffer 洗滌3 次 后，滴加化學發光液，在凝膠成像系統中拍照，用ImageJ1.6.0軟件對蛋白表達進行定量分析。

1.11 數據處理

采用SPSS26.0 統計軟件對數據進行統計分析。所有數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 健脾解毒湯聯合5?FU 對胃癌大鼠血清MTL、PGI及GAS的影響

如表1所示，與空白對照組比較，胃癌模型組大鼠血清MTL、PGI及GAS 水平顯著降低（P＜0.05）；與胃癌模型組比較，健脾解毒湯組、5?FU 組及健脾解毒湯聯合5?FU 組大鼠血清MTL、PGI及GAS 水平顯著升高（P＜0.05），且健脾解毒湯聯合5?FU 組大鼠血清MTL、PGI及GAS 水平較單獨使用健脾解毒湯組或5?FU組顯著升高（P＜0.05）。

2.2 健脾解毒湯聯合5?FU對胃癌大鼠胃組織TNF?α、Bax及Bcl?2的影響

如表2所示，與空白對照組比較，胃癌模型組大鼠胃組織TNF?α及Bcl?2 水平顯著升高（P＜0.05），Bax水平顯著降低（P＜0.05）；與胃癌模型組比較，健脾解毒湯組、5?FU 組及健脾解毒湯聯合5?FU 組大鼠胃組織TNF?α及Bcl?2 水平顯著降低（P＜0.05），Bax 水平顯著升高（P＜0.05），且健脾解毒湯聯合5?FU 組大鼠胃組織TNF?α及Bcl?2水平較單獨使用健脾解毒湯組或5?FU 組均顯著降低（P＜0.05），Bax水平顯著升高（P＜0.05）。

2.3 健脾解毒湯聯合5?FU 對胃癌大鼠胃組織病理變化的影響

如圖1 所示，空白對照組大鼠胃腺及上皮細胞結構形態正常，無明顯病理性改變。與空白對照組比較，胃癌模型組大鼠胃組織上皮細胞結構紊亂，腺體結構擁擠，細胞異型性改變，極性喪失，細胞核染色加深，核質比增大；與胃癌模型組比較，健脾解毒湯組、5?FU 組及健脾解毒湯聯合5?FU 組大鼠胃組織病理學不同程度改善。

2.4 健脾解毒湯聯合5?FU 對胃癌大鼠胃組織p53及YAP1 mRNA水平的影響

如表3 所示，結果表明，與空白對照組比較，胃癌模型組大鼠胃組織p53 及YAP1 mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）；與胃癌模型組比較，健脾解毒湯組、5?FU 組及健脾解毒湯聯合5?FU 組大鼠胃組織p53及YAP1 mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），且健脾解毒湯聯合5?FU組大鼠胃組織p53及YAP1 mRNA水平較單獨使用健脾解毒湯組或5?FU 組均顯著降低（P＜0.05）。

2.5 健脾解毒湯聯合5?FU 對胃癌大鼠胃組織p53及YAP1蛋白水平的影響

如圖2 所示，結果表明，與空白對照組比較，胃癌模型組大鼠胃組織p53 及YAP1 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與胃癌模型組比較，健脾解毒湯組、5?FU 組及健脾解毒湯聯合5?FU 組大鼠胃組織p53 及YAP1 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），且健脾解毒湯聯合5?FU 組大鼠胃組織p53 及YAP1 蛋白水平較單獨使用健脾解毒湯組或5?FU 組均顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清MTL、PGI及GAS的比較Table 1 Comparison of serum MTL，PGI and GAS levels in each group(±s)

表1 各組大鼠血清MTL、PGI及GAS的比較Table 1 Comparison of serum MTL，PGI and GAS levels in each group(±s)

與空白對照組比較：*P＜0.05；與胃癌模型組比較：#P＜0.05；與健脾解毒湯組比較：&P＜0.05；與5?FU組比較：$P＜0.05。

組別空白對照組胃癌模型組健脾解毒湯組5?FU組健脾解毒湯聯合5?FU組N 12 11 12 11 11 ρ（MTL）/（pg·mL-1）163.29±1.22 104.28±1.61*115.65±1.36#132.22±1.08#&154.86±1.34#&$ρ（PGI）/（ng·mL-1）7.89±0.34 3.11±0.18*4.25±0.69#5.87±0.39#&7.19±0.52#&$ρ（GAS）/（pg·mL-1）118.13±1.53 66.29±1.88*78.61±1.55#90.25±1.48#&106.21±1.73#&$

表2 各組大鼠胃組織TNF?α、Bax及Bcl?2水平的比較Table 2 Comparison of TNF?α，Bax and Bcl?2 levels in gastric tissues of each group rats (±s) ρ/(ng·mL-1)

表2 各組大鼠胃組織TNF?α、Bax及Bcl?2水平的比較Table 2 Comparison of TNF?α，Bax and Bcl?2 levels in gastric tissues of each group rats (±s) ρ/(ng·mL-1)

與空白對照組比較：*P＜0.05；與胃癌模型組比較：#P＜0.05；與健脾解毒湯組比較：&P＜0.05；與5?FU組比較：$P＜0.05。

組別空白對照組胃癌模型組健脾解毒湯組5?FU組健脾解毒湯聯合5?FU組12 11 12 11 11 23.46±1.12 48.53±1.33*41.21±0.89#36.21±0.90#&30.67±0.74#&$85.60±1.55 22.56±1.34*38.53±2.44#51.40±0.82#&77.65±1.64#&$12.18±1.47 42.84±1.88*32.85±0.82#26.11±0.73#&18.51±0.55#&$

圖1 大鼠胃組織病理檢查結果（HE，200×）Figure 1 Histopathological examination of rat stomach tissues(HE staining,200×)

表3 各組大鼠胃組織p53及YAP1 mRNA水平的比較Table 3 Comparison of p53 and YAP1 mRNA levels in gas?tric tissues of each group rats (±s)

表3 各組大鼠胃組織p53及YAP1 mRNA水平的比較Table 3 Comparison of p53 and YAP1 mRNA levels in gas?tric tissues of each group rats (±s)

與空白對照組比較：*P＜0.05；與胃癌模型組比較：#P＜0.05；與健脾解毒湯組比較：&P＜0.05；與5?FU組比較：$P＜0.05。

組別空白對照組胃癌模型組健脾解毒湯組5?FU組健脾解毒湯聯合5?FU組N 12 11 12 11 11 p53 mRNA相對表達量0.78±0.23 4.82±0.94*3.17±0.17#1.98±0.28#&1.23±0.12#&$YAP1 mRNA相對表達量1.15±0.79 5.41±0.26*3.09±0.19#2.17±0.34#&1.68±0.33#&$

圖2 各組大鼠胃組織p53及YAP1蛋白水平的比較Figure 2 Comparison of p53 and YAP1 protein levels in gas?tric tissues of each group rats

3 討論

胃癌是由胃黏膜上皮病變引起的消化道惡性腫瘤，其發病具有性別及地區差異。胃癌的發病機制與飲食習慣、胃部炎癥病變、幽門螺旋桿菌感染及家族遺傳等多種因素有關[8]。由于胃癌早期臨床癥狀與胃炎、胃潰瘍等癥狀表現相似，特異性不明顯，容易被忽略，導致胃癌早期診斷率較低，也是導致胃癌患者預后較差、死亡率高的原因之一。胃癌的臨床治療目前主要包括外科手術治療及藥物治療等，但都存在有效率低、復發率高、預后效果差等多種缺點[9]，所以對于胃癌治療藥物的探索仍是臨床的工作重點。5?FU 是胸苷酸合成酶抑制劑，用于胃癌等多種消化道腫瘤疾病的治療，然而近年來臨床研究表明5?FU用于胃癌的治療中出現有效率低，預后效果較差[10]，所以5?FU 與其他藥物聯合應用用于胃癌的治療成為臨床中探索的新方向。

健脾解毒湯是基于中醫理論，由生黃芪、生白術等多種傳統中藥材組成的中藥成方制劑，具有健脾和胃、清熱解毒的功效。方中生黃芪為君藥，性溫味甘，起到健脾和胃的功效，生白術有補中益氣、祛濕除熱的功效，為臣藥，野葡萄藤清熱利濕、消腫解毒，薏苡仁味甘性涼、利水透濕、解毒散結，八月札散瘀止痛、理氣活血，諸藥合用起到散瘀止痛、清熱解毒之功效?，F代醫學研究發現[11]，健脾解毒湯具有抗腫瘤、免疫調節及抗消化性潰瘍等多種藥理作用。近年來，有研究發現健脾解毒湯在胃癌的治療中表現出顯著療效，袁旭等[5]臨床研究發現，在奧沙利鉑聯合替吉奧化療的基礎上給予胃癌患者健脾解毒湯，結果發現健脾解毒湯聯合化療組胃癌患者疾病控制率、無進展生存期均顯著提高，同時顯著減少神經毒性及乏力等不良反應的發生率；何群英等[4]發現健脾解毒湯能顯著提高胃癌患者化療效果，并降低化療引起的惡心、嘔吐等不良反應的發生率。由此可見健脾解毒湯在胃癌的治療中具有較大潛力。

MTL、PGI、GAS水平是反映胃組織細胞正常功能的指標，胃黏膜組織細胞病變時，MTL、GAS 水平顯著降低，胃組織功能明顯降低[12]；PGI是反映胃黏膜細胞形態和功能的重要指標，吳異蘭等[13]研究報道了血清PGI水平降低是胃癌進展、胃組織黏膜細胞病變的的重要標志。本實驗結果表明，胃癌模型大鼠血清MTL、PGI、GAS 水平顯著降低，給予大鼠健脾解毒湯及5?FU后，大鼠血清MTL、PGI、GAS水平有不同程度的恢復，且健脾解毒湯聯合5?FU組較健脾解毒湯組及5?FU組均明顯升高，提示健脾解毒湯聯合5?FU能夠顯著改善胃癌大鼠胃功能指標，促進胃組織細胞功能的恢復，其效果優于5?FU單獨化療組。胃癌組織TNF?α水平是反映胃組織病變程度的指標之一，袁虎勤等[14]研究發現胃癌組織內TNF?α水平顯著升高與胃癌病變程度及進展有關，抑制TNF?α水平則能夠阻止胃組織進一步癌變；黃國棟等[15]研究表明抑制胃癌組織內TNF?α水平能夠通過調節細胞凋亡進而阻止胃癌進展。Bax及Bcl?2是與細胞凋亡相關的蛋白，Bax為促凋亡蛋白，其水平升高提示組織細胞凋亡率升高，Bcl?2為抗凋亡蛋白，其水平升高提示組織細胞趨向異常增殖。鄭拓等[16]研究發現胃癌MGC80?3 細胞Bax 水平顯著降低，Bcl?2 水平升高與MGC80?3 細胞的異常增殖有關，而提高Bax水平，降低Bcl?2水平則能夠促進胃癌細胞的凋亡。肖麟等[17]研究也表明胃癌大鼠Bcl?2水平升高及Bax 水平降低與胃癌進展及預后有關。本研究結果表明，胃癌大鼠胃組織TNF?α及Bcl?2水平升高，Bax水平降低，給予胃癌大鼠健脾解毒湯及5?FU后，大鼠胃組織TNF?α及Bcl?2水平不同程度降低，Bax水平升高，且聯合給藥組相關指標變化較5?FU單獨給藥組效果更明顯，提示健脾解毒湯能顯著調節凋亡相關蛋白變化，進而調節胃癌的疾病進展。

p53/Hippo通路是調控細胞增殖、遷移的重要信號通路，該通路相關蛋白水平的異常改變則會導致細胞的異常增殖，因此肺癌、胃癌等多種腫瘤疾病的發生均與該通路相關。林海鵬等[18]報道了胃癌患者腫瘤組織中p53 蛋白水平顯著升高，且影響胃癌的進展及腫瘤TNM 分期；徐鋮等[19]也報道了p53 水平的升高與胃癌的腫瘤分期及分化程度呈正相關。YAP1 是Hippo 通路中與胃癌發生發展密切相關的蛋白，付婭等[20]研究發現胃癌組織中YAP1 顯著升高與胃癌細胞的侵襲過程密切相關，賈業貴等[21]發現YAP1 蛋白水平與胃癌的惡性程度表現出相關性，且YAP1 蛋白水平越高，胃癌惡性程度也越高。本實驗結果表明，胃癌模型大鼠體內p53及YAP1水平均顯著升高，而健脾解毒湯組、5?FU 組及聯合給藥組大鼠p53及YAP1水平均有不同程度的降低，且聯合給藥組大鼠p53及YAP1水平降低更明顯，提示健脾解毒湯聯合5?FU 可能通過調節p53/Hippo 通路，進而發揮對胃癌大鼠的改善作用。

綜上所述，健脾解毒湯聯合5?FU能夠顯著恢復胃癌大鼠胃組織功能，調節胃組織炎癥因子及細胞凋亡相關蛋白水平，改善胃組織病理改變，其機制可能與調節p53/Hippo通路有關。