蘿卜硫素對(duì)自身免疫性甲狀腺炎小鼠的作用及機(jī)制

李智奇，喻濤

（深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院甲乳外科，廣東深圳518109）

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis,AIT）是一種自身免疫功能紊亂所引起的甲狀腺疾病，其臨床癥狀多樣，但其主要癥狀有甲狀腺腫、甲狀腺功能減退和甲狀腺組織纖維化等[1]。而在AIT多種類(lèi)型中，橋本甲狀腺炎（Hashimoto's thyroiditis，HT）最為常見(jiàn)和典型，占甲狀腺疾病的22.5%左右[2]。隨著人們生活方式的改變以及生活水平的逐步提高，HT 的發(fā)病率有不斷上升的趨勢(shì)[3]。雖然研究表明AIT的發(fā)病與炎癥、免疫、氧化損傷和凋亡等有關(guān)[4?7]，但其具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。雖然臨床上使用的抗AIT藥物，如糖皮質(zhì)激素、左旋甲狀腺素、雷公藤多苷片等能獲得一定療效，但存在不良反應(yīng)多以及斷藥易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)[8]，故尋找新的替代藥物仍刻不容緩。

蘿卜硫素，又稱(chēng)“萊菔硫烷”，是一種異硫氰酸鹽，是芥屬的十字花科植物所富含的一種由芥子苷水解后所得的水溶性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等生物學(xué)效應(yīng)[9?11]。基于目前蘿卜硫素對(duì)自身免疫性甲狀腺炎的實(shí)驗(yàn)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)利用BALB/c 小鼠通過(guò)皮下多點(diǎn)注射豬甲狀腺球蛋白以及聯(lián)合高碘水的方法構(gòu)建小鼠自身免疫性甲狀腺炎模型（experimental autoim?mune thyroiditis,EAT），用于進(jìn)一步探討蘿卜硫素對(duì)EAT的作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SPF級(jí)、雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2019?0002。

1.2 藥品與試劑

蘿卜硫素（廈門(mén)旭麗金生物科技有限公司）；豬甲狀腺球蛋白（PTg）、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑（Sigma 公司）；碘化鈉（NaI，金錦樂(lè)化學(xué)有限公司）；雷公藤多苷片（10 mg/片，貴州漢方藥業(yè)有限公司）；小鼠TPOAb 化學(xué)發(fā)光試劑盒和小鼠TGAb 化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海安妍生物有限公司）；IL?6、IL?17和IL?23 ELISA 檢測(cè)試劑盒（深圳市科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司）；EGFR 和Nrf2 單克隆抗體（Abcam公司）。

1.3 主要儀器

800TS 吸收光酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek 伯騰公司）；IX71 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；JYD?325 型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（金華市宇典醫(yī)療器械廠）；WD?9413C型凝膠成像分析系統(tǒng)（福州申輝化工儀器設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 EAT模型建立

參照文獻(xiàn)[12]等方法構(gòu)建小鼠EAT 模型，將PTg 與完全弗氏佐劑按體積比1∶1 制成油包水乳劑，制備質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL。按50 μg/只的劑量從動(dòng)物背部皮下選取多個(gè)注射點(diǎn)注射上述自制的乳劑，給藥頻次為1次/周，給藥周期為2周。從第3 周開(kāi)始注射由不完全弗氏佐劑聯(lián)合PTg 乳化的油包水乳劑，制備質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 的清液，給藥劑量和頻次同上，給藥周期為3周，每周的注射部位分別為背部皮下、頸部皮下以及腹腔，每日正常自由飲用高碘水（質(zhì)量濃度為0.63 mg/mL）。

2.2 分組與給藥

實(shí)驗(yàn)共分為6 組，分別為空白對(duì)照組、模型組、雷公藤多苷片組、蘿卜硫素低劑量組、蘿卜硫素中劑量組、蘿卜硫素高劑量組，每組10只。造模完成后給藥，其中雷公藤多苷片組給藥劑量為5 mg/（kg·d），蘿卜硫素低、中、高劑量組給藥劑量分別為5、10、20 mg/（kg·d），給藥方式為灌胃給藥，其余兩組灌胃給予等體積生理鹽水，1次/d，共30 d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，10%（φ）水合氯醛腹腔注射麻醉，以摘眼球方式取血，4 ℃冰箱放置2 h，3 000 r/min 4 ℃冰凍離心5 min，分離血清并保存?zhèn)溆谩Ｃ嘎?lián)免疫法分別檢測(cè)血清中TGAb、TPOAb、IL?6、IL?17 和IL?23水平。小心分離小鼠甲狀腺組織，10%（φ）中性甲醛溶液浸泡固定左側(cè)甲狀腺組織，用于石蠟切片、HE染色，觀察甲狀腺組織的病理學(xué)變化。Western blot 法檢測(cè)甲狀腺組織勻漿中EGFR 和Nrf2 蛋白含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（單因素方差分析），計(jì)量資料以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蘿卜硫素對(duì)各組小鼠甲狀腺組織病理學(xué)變化的影響

空白對(duì)照組小鼠甲狀腺組織中腺泡呈立方狀，間質(zhì)厚度正常，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡腔內(nèi)的膠質(zhì)分布均勻（圖1A）。模型組小鼠甲狀腺結(jié)構(gòu)異常，濾泡間隔變厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1B）。相對(duì)模型組，雷公藤多苷片組和蘿卜硫素給藥組以上病理征有不同程度的改善，可見(jiàn)甲狀腺濾泡間隔變薄，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，其中蘿卜硫素高劑量組和雷公藤多苷片組改善效果最好（圖1C-F）。

圖1 各組小鼠甲狀腺組織病理形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，200×）Figure 1 Histomorphological observation of thyroid gland in each group of mice

3.2 蘿卜硫素對(duì)各組小鼠血清TGAb 和TPOAb 水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清TPOAb和TGAb含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，雷公藤多苷片組和蘿卜硫素給藥組小鼠血清TPOAb 和TGAb含量均明顯降低（P＜0.01）。與蘿卜硫素低劑量組比較，雷公藤多苷片組和蘿卜硫素高劑量組小鼠血清TGAb和TPOAb含量明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠血清TPOAb和TGAb的水平變化Figure 2 Changes in serum TPOAb and TGAb levels in each group of mice(±s,n=10)

3.3 蘿卜硫素對(duì)各組小鼠血清IL?6、IL?17 和IL?23水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清IL?6、IL?17 和IL?23 水平均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，雷公藤多苷片組和蘿卜硫素給藥組小鼠血清IL?6、IL?17 和IL?23 水平均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。與蘿卜硫素低劑量組比較，雷公藤多苷片組和蘿卜硫素高劑量組小鼠血清IL?6 和IL?23 水平明顯降低（P＜0.05）。蘿卜硫素高劑量組還可降低小鼠血清IL?17的水平（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠血清IL?6、IL?17和IL?23的水平變化Figure 3 Changes of serum IL?6，IL?17 and IL?23 levels in each group of mice(±s,n=10)

3.4 蘿卜硫素對(duì)各組小鼠甲狀腺組織EGFR 和Nrf2 蛋白的表達(dá)水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠甲狀腺組織EGFR 蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.01），而Nrf2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，雷公藤多苷片組和蘿卜硫素給藥組小鼠甲狀腺組織EGFR 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），而Nrf2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）。與蘿卜硫素低劑量組比較，雷公藤多苷片組和蘿卜硫素高劑量組小鼠甲狀腺組織EGFR蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），而Nrf2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠甲狀腺組織EGFR和Nrf2 蛋白的表達(dá)水平Figure 4 Expression levels of EGFR and Nrf2 proteins in thyroid tissues of various groups of mice(±s,n=10)

4 討論

自身免疫性甲狀腺炎是一種臨床上常見(jiàn)的甲狀腺疾病，屬于特異性自身免疫病范疇。雖然目前用于建立EAT動(dòng)物模型較多[13]，其中高碘聯(lián)合Tg的造模方法以造模方法簡(jiǎn)單以及成功率較高的特點(diǎn)，成為建立EAT 動(dòng)物模型的理想方法[14?15]。雷公藤多苷對(duì)EAT 的藥效早已有研究證實(shí)[16]，雷公藤多苷片具有祛風(fēng)解毒、除濕消腫和舒經(jīng)通絡(luò)的作用，用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，研究表明其藥理作用包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及抗氧化損傷等[17]。故本研究選取雷公藤多苷片作為蘿卜硫素的陽(yáng)性對(duì)照藥，探討蘿卜硫素對(duì)小鼠EAT模型的治療效果。

蘿卜硫素具有抗氧化、抗炎及抗癌等多種生物活性[9?11]。其作用機(jī)制涉及激活Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)多種抗氧化蛋白的表達(dá)，下調(diào)NF?kB 信號(hào)通路蛋白和TNF?α、TGF?β等炎癥因子的表達(dá)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組甲狀腺部分濾泡間質(zhì)變厚，纖維結(jié)締組織增生，有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血清TGAb、TPOAb 含量顯著升高，與吳朝文等[12]研究一致，提示EAT 模型建立成功。給予不同劑量的蘿卜硫素可不同程度改善上述指標(biāo)。可見(jiàn)，不同劑量的蘿卜硫素可顯著改善EAT 的病理學(xué)變化和自身抗體的水平，呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)關(guān)系。雷公藤多苷片組的作用效果與蘿卜硫素高劑量組相似。

近年來(lái)，Th17 細(xì)胞在AIT 發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用逐漸引起科研工作者的注意，其中IL?17 是一種主要由Th17 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，也是Th17 細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)的最為主要的細(xì)胞因子之一，全程介導(dǎo)了AIT 致病過(guò)程的炎癥反應(yīng)和免疫損傷[19]。而IL?23參與了Th17 細(xì)胞的增殖和分化調(diào)節(jié)，是Th17 細(xì)胞增殖和分化的重要細(xì)胞因子。此外，IL?17 和IL?23可形成特殊的炎性軸，激活多條炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)多種炎癥因子的表達(dá)，如IL?6，形成復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)，在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮極為重要的作用[20]。本研究結(jié)果表明不同劑量的蘿卜硫素可明顯降低血清IL?6、IL?17和IL?23的含量，提示蘿卜硫素可能抑制Th17細(xì)胞炎癥因子的釋放，從而減輕EAT的炎癥。雷公藤多苷片組的作用效果與蘿卜硫素高劑量組相似。

組織表皮生長(zhǎng)因子是體內(nèi)多種激素生長(zhǎng)和發(fā)育所需的重要物質(zhì)，如甲狀腺素和性激素等，組織表皮生長(zhǎng)因子與其受體EGFR結(jié)合后活化并傳導(dǎo)一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，如EGFR 表達(dá)異常可引起甲狀腺細(xì)胞增殖和發(fā)育異常[21]。而Nrf2 是體內(nèi)一種有效的抗氧化損傷的重要轉(zhuǎn)錄因子，可保護(hù)甲狀腺細(xì)胞免受機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。當(dāng)甲狀腺處于氧化應(yīng)激條件下，Nrf2 可磷酸化并與Keaol蛋白解離，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與ARE結(jié)合，從而啟動(dòng)下游多個(gè)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，以此對(duì)抗機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)[22]。不同濃度的蘿卜硫素可顯著下調(diào)甲狀腺組織EGFR蛋白表達(dá)水平，上調(diào)Nrf2 蛋白的表達(dá)水平，提示其可從抑制甲狀腺細(xì)胞異常發(fā)育以及抗氧化損傷的層面保護(hù)甲狀腺細(xì)胞。雷公藤多苷片組的作用效果與蘿卜硫素高劑量組相似。

本研究結(jié)果表明，蘿卜硫素可減輕自身免疫性甲狀腺炎的炎癥水平，下調(diào)甲狀腺組織EGFR 蛋白表達(dá)水平，上調(diào)Nrf2 蛋白表達(dá)水平，從而改善甲狀腺功能，該研究為蘿卜硫素在抗AIT 的臨床應(yīng)用提供了部分理論依據(jù)。