清肺利咽顆粒UPLC指紋圖譜研究

江潔怡，黃華靖，楊敏娟，李素梅，李養學，畢曉黎

（1.廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東廣州510095；2.廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東廣州510095；3.廣州中醫藥大學第五臨床醫學院，廣東廣州510405）

慢性咽炎為咽部黏膜、黏膜下及淋巴組織的慢性炎癥，具有發病率高、病程久、復發率高、癥狀頑固、不易治愈等特點，嚴重影響著人們的正常生活。慢性咽炎屬中醫“喉痹”病證范疇[1]，清肺利咽顆粒為廣東省第二中醫院在中醫藥理論的基礎上，根據中醫臨床經驗處方開發而成的院內制劑，由玄參、天冬、知母、炒白芍、蟬蛻、射干、西青果、木蝴蝶、甘草、桔梗組成，其中玄參清熱涼血、瀉化滋陰，天冬養陰潤燥、清肺生津，知母清熱瀉火、滋陰潤燥，炒白芍養血斂陰，蟬蛻疏散風熱、利咽開音，射干清熱解毒、消痰利咽，西青果清熱生津、利咽解毒，木蝴蝶清肺利咽，甘草酸甘化陰、調和諸藥，桔梗祛痰利咽、引藥入經，諸藥合用，共奏清熱養陰、利咽生津之功，臨床上對慢喉痹虛火上炎證有良好的療效。

該制劑臨床應用多年，療效確切，深受患者喜愛，為了進一步的開發推廣，本課題組前期已采用薄層色譜法（TLC）建立了方中玄參、知母、炒白芍、甘草4 味藥的定性鑒別方法，同時采用高效液相色譜法（HPLC）建立方中芒果苷的含量測定方法，但以上方法指標成分單一，難以對其內在質量進行全面控制。指紋圖譜是基于多指標成分對中藥制劑進行質量控制的有效手段，指紋圖譜結合模式識別方法能有效彌補現有質量控制方法的不足[2]。本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）對12批清肺利咽顆粒進行指紋圖譜研究，應用指紋圖譜相似度評價結合主成分分析法進行分析，為清肺利咽顆粒的全面質量控制提供科學依據，為其開發成為安全有效、穩定可控的中藥制劑奠定基礎。

1 儀器與試劑

Agilent 1290 色譜儀（美國Agilent 公司）；KQ5200DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER XS205 DU 型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler?Toledo 公司）；HH?8 數顯恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）；Milli?Q Advan?tage A10自動純水機（美國MilliPore公司）。

乙腈、磷酸等液相用試劑為色譜純（德國Merck公司），水為屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司），其余試劑均為分析純（廣州化學試劑廠）；清肺利咽顆粒[批號：20181001、20181002、20181003、20190401、20190402、20190403、20191001、20191002、20191003、20200401、20200402、20200403，依次編號為S1-S12，規格：每袋裝15 g（每1 g 相當于飲片1.40 g）]由廣東省第二中醫院制劑室提供；沒食子酸（批號：110831?201204，純度：91.5%）、芒果苷（批號：111607?200402，純度：98.1%）、芍藥苷（批號：110736?201741，純度：96.8%）、鞣花酸（批號：111959?201606，純度：88.8%）、射干苷（批號：111632?200501，純度：98.7%）、黃芩苷（批號：110715?201821，純度：95.4%）、肉桂酸（批號：110786?201604，純度：98.8%）、黃芩素（批號：111595?201808，純度：97.9%）、次野鳶尾黃素（批號：111557?200602，純度：99.9%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；羥基芍藥苷（批號：Q?019?160627，純度：＞98%）、芍藥內酯苷（批號：S?011?180908，純度：＞98%）、甘草酸銨（批號：G?003?150917，純度：＞98%）對照品均購于成都瑞芬思生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Waters Cortecs T3（2.1 mm×150 mm，1.6 μm）為色譜柱；柱溫為25 ℃；以乙腈（A）?0.1%磷酸（B）為流動相，進行梯度洗脫（0～3 min，5%→8%A；3～18 min，8%→25%A；18～25 min，25%→40%A；25～29 min，40%→60%A）；流速為0.35 mL/min；檢測波長為245 nm、280 nm；進樣量為1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液取清肺利咽顆粒適量，研細，精密稱取約2 g，置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入50%（體積分數，下同）甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率：300 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷至室溫，再次稱定質量，并用50%甲醇補足減失的質量，超速離心（轉速：10 000 r/min）5 min，取上清，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液分別精密稱取沒食子酸、羥基芍藥苷、芍藥內酯苷、芒果苷、芍藥苷、鞣花酸、射干苷、黃芩苷、肉桂酸、黃芩素、甘草酸銨、次野鳶尾黃素對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL 含343.6、1310、159.1、218.4、306.2、256.0、103.6、247.1、21.36、223.8、135.6、151.2 μg的對照品溶液，備用。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗取同一供試品溶液（S12），按“2.1”項色譜條件，連續測定6 次，記錄色譜圖，以芍藥苷（8 號峰）為參照，計算出23 個共有峰的相對保留時間（RRT）及相對峰面積（RPA），結果RSD 均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗取同一供試品溶液（S12），按“2.1”項色譜條件，分別于供試品溶液制備后第0、2、4、6、8、12 h 進樣測試，記錄色譜圖，以芍藥苷（8 號峰）為參照，計算出23個共有峰的RRT及RPA，結果RSD 均小于2%，表明供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗分別取同一批次樣品（S12），按“2.2”項供試品溶液制備方法，平行處理6 份供試品溶液，并按“2.1”項色譜條件，進樣測定，記錄色譜圖，以芍藥苷（8 號峰）為參照，計算出23 個共有峰的RRT 及RPA，結果RSD 均小于2%，表明方法重復性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立及相似度評價分別取12批清肺利咽顆粒樣品，按“2.2”項方法制備供試品溶液，再分別精密吸取各對照品溶液適量，加甲醇配制成分別含沒食子酸34.36 μg/mL、羥基芍藥苷39.30 μg/mL、芍藥內酯苷7.955 μg/mL、芒果苷10.92 μg/mL、芍藥苷45.92 μg/mL、鞣花酸51.20 μg/mL、射干苷5.180 μg/mL、黃芩苷12.36 μg/mL、肉桂酸2.136 μg/mL、黃芩素11.19 μg/mL、甘草酸銨13.56 μg/mL、次野鳶尾黃素7.560 μg/mL 的混合對照品溶液，吸取上述混合對照品溶液1 μL，按“2.1”項色譜條件進樣測定，同時記錄245 nm、280 nm 下色譜圖，并分別將其導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2.0 版）”，以S12 為參照圖譜，以中位數法，時間窗0.1 min，全譜自動匹配，生成對照指紋圖，見圖1-2。共標定了23 個峰為特征峰，通過與對照品保留時間及紫外吸收光譜比對，歸屬指認了其中2 號峰為沒食子酸、4 號峰為羥基芍藥苷、5 號峰為芍藥內酯苷、6 號峰為芒果苷、8 號峰為芍藥苷、10號峰為鞣花酸、11號峰為射干苷、16號峰為黃芩苷、17號峰為肉桂酸、19號峰為黃芩素、21號峰為甘草酸銨、22號峰為次野鳶尾黃素，見圖3。

圖1 12 批清肺利咽顆粒UPLC 疊加圖譜和對照指紋圖譜（245 nm）Figure 1 UPLC characteristic chromatograms overlapping and comparison fingerprint of 12 batches of Qingfei Liyan granule(245 nm)

12 批清肺利咽顆粒供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.99，見表1。結果表明，12批次樣品所含化學成分相似，清肺利咽顆粒原藥材質量與制劑工藝較穩定。

2.3.5 化學模式識別分析

圖2 12 批清肺利咽顆粒UPLC 疊加圖譜和對照指紋圖譜（280 nm）Figure 2 UPLC characteristic chromatograms overlapping and comparison fingerprint of 12 batches of Qingfei Liyan granule(280 nm)

圖3 清肺利咽顆粒UPLC圖譜Figure 3 UPLC chromatograms of Qingfei Liyan granule

表1 相似度評價結果Table 1 Similarity evaluation results

2.3.5.1 聚類分析以指紋圖譜中23 個共有峰的峰面積標準化處理后數據為變量，運用SPSS 26.0 軟件對12 批清肺利咽顆粒樣品進行系統聚類分析（CA），采用組間聯接聚類法，選取平方Euclidean 距離作為度量標準，全距從0～1作標準化，進行聚類分析，結果見圖4。從樹狀圖結果得知，當平方Euclidean距離為15時，12個樣品被分為兩類，S7-S9為一類，其他批次聚為一類，其中S7-S9 批次為2019 年10月生產的3 批樣品，聚類分析能將不同時間生產的樣品進行初步的分類，表明清肺利咽顆粒的質量受到原藥材質量等條件影響，為制劑生產的原藥材質量把控提供了實驗依據。

圖4 系統聚類分析圖Figure 4 System cluster analysis

2.3.5.2 主成分分析以指紋圖譜中23個共有峰的峰面積標準化處理后數據為變量，運用SIMCA 14.1軟件對12 批清肺利咽顆粒樣品進行主成分分析（principal components analysis, PCA），選取特征值最大的兩個主成分進行擬合分析，其累積方差貢獻率分別為70.01%、84.8%，得到12 批清肺利咽顆粒樣品的PCA 得分圖，見圖5。結果顯示所有樣品均在95%可信區間內，且能分為兩類，S7-S9 為一類，其他批次為一類，與CA分析結果一致。

圖5 PCA分析得分圖Figure 5 PCA score

以指紋圖譜中23 個共有峰的峰面積標準化處理后數據為變量，運用SPSS 26.0 軟件對12 批清肺利咽顆粒樣品進行PCA 分析，以特征值大于3 為判斷標準，得主成分特征值、方差貢獻率和主成分因子載荷矩陣，見圖6、表2-3。其中，前2個成分的特征值分別為16.10、3.413，累計方差貢獻率分別為70.01%、84.8%，表明前2 個主成分能夠充分體現出樣品的基本特征和主要信息，與SIMCA 14.1結果一致。通過因子載荷矩陣得知，峰1、2（沒食子酸）、3、4（羥基芍藥苷）、5（芍藥內酯苷）、6（芒果苷）、8（芍藥苷）、9、11（射干苷）、12、15、16（黃芩苷）、17（肉桂酸）、18、19（黃芩素）、20、21（甘草酸銨）、22（次野鳶尾黃素）、23在主成分1上有較高載荷，對主成分1 產生主要影響；峰6（芒果苷）、7、10（鞣花酸）在主成分2 上有較高載荷，對主成分2 產生主要影響。表明上述成分在特征變量的重要性評估中具有優勢，對其進行含量監測，對清肺利咽顆粒的質量控制具有重要的意義。

圖6 PCA分析碎石圖Figure 6 PCA scree plot

表2 特征值與方差貢獻率Table 2 Eigenvalue and variance contribution rate

表3 主成分因子載荷矩陣Table 3 Factor loading matrix

3 討論

由于復方制劑成分復雜，不同組成在不同波段的吸收強度有較大的差異，在檢測波長考察過程中，采用紫外210～400 nm 全波長掃描，結果發現245 nm 處，能包含絕大部分成分的色譜峰，但仍有部分成分245 nm 不出峰或吸收較弱；而同時對280 nm 進行檢測，可兼顧245 nm下不出峰的成分，且280 nm 接近部分含測指標成分的最大吸收，在此波長下進行含量測定，可增加結果的準確度，故最終選擇同時檢測245 nm、280 nm。先后考察了不同色譜柱（Waters CORTECS UPLC T3、Waters ACQUI?TY UPLC BEH Shield RP C18、Phenomenex Kinetex XB C18）、不同流動相體系（乙腈?水、乙腈?0.1%甲酸、甲醇?0.1%磷酸）、不同柱溫（20、25、30 ℃）以及不同流速（0.25、0.30、0.35 mL/min），最終確定了“2.1”項下色譜條件。

清肺利咽顆粒由玄參、天冬、知母、炒白芍、蟬蛻、射干、西青果、木蝴蝶、甘草、桔梗等水煎、濃縮、制粒而成，其中玄參中的肉桂酸成分，具有抗氧化、抗菌、神經保護等作用[3?4]；知母所含的芒果苷具有鎮咳、祛痰、平喘、抗氧化、抗炎、抗菌等作用[5?6]；以芍藥苷和芍藥內酯苷為代表的單萜及其苷類成分是白芍中公認的藥效物質，具有廣泛的抗炎鎮痛、減毒增效等作用[7?8]；沒食子酸、鞣花酸等多酚是西青果中主要藥效成分，具有抗氧化、抗炎抑菌等作用[9?11]；黃芩苷、黃芩素等黃酮類成分為木蝴蝶發揮抗氧化、抗炎抑菌藥理作用的主要成分[12?13]；射干苷、次野鳶尾黃素等黃酮類成分是射干中的主要藥效成分，具有抗氧化、抗炎抑菌等作用[14?15]；甘草具有清熱解毒、祛痰止咳的作用，其中甘草酸具有抑菌、抗病毒等作用[16?17]。本研究建立了全方指紋圖譜，并對方中所含的沒食子酸、羥基芍藥苷、芍藥內酯苷、芒果苷、芍藥苷、鞣花酸、射干苷、黃芩苷、肉桂酸、黃芩素、甘草酸銨、次野鳶尾黃素等12個成分進行指認與控制，指標成分兼顧君臣佐使，對清肺利咽顆粒的質量控制達到整體、全面的效果。

據報道，方中玄參、知母、桔梗等藥味中，仍存在系列的皂苷類活性成分，此類成分難以通過紫外檢測器進行測定，需采用蒸發光檢測器（ELSD）等[18]，下一步將繼續對其測定方法進行探索。

12 批清肺利咽顆粒指紋圖譜相似度較高，制備工藝、質量較穩定，質量差異主要表現在各成分含量上，各批次之間的成分含量差異可能與投料藥材的產地、采收期等因素有關，仍需對其藥材來源進行進一步的分析、控制，以保證產品質量的穩定性。本研究僅從化學成分層面出發，對清肺利咽顆粒質量進行控制，下一步可結合藥理研究，明確其質量標志物，保證產品的安全、有效。