多指標綜合評分法結合正交試驗優選參棗滴丸的水提工藝

王佳雪，劉渠，2，3，簡尚宇，胡濤，2，3，梁生旺，2，3，王淑美，湯丹，2，3，張陸勇

（廣東藥科大學1.中藥學院；4.藥學院；5.新藥研發中心，廣東廣州510006；2.國家中醫藥管理局中藥數字化質量評價技術重點研究室，廣東廣州510006；3.廣東省中藥質量工程技術研究中心，廣東廣州510006）

參棗滴丸為本課題組在研中藥新藥，由廣棗、丹參、人參、降香等組成，具有理氣止痛、活血化瘀等功效，用于治療冠心病、心絞痛等病癥[1]。研究表明，廣棗的主要化學成分包括黃酮類、酚酸類等[2]，主要有效成分為沒食子酸，可明顯改善心肌梗死后心肌纖維化[3]。丹參中含有的主要化學成分為丹參酮ⅡA等丹參酮類脂溶性成分和丹酚酸B 等酚酸類水溶性成分[4]，丹酚酸B 對防治動脈粥樣硬化有明顯作用[5]。人參皂苷和多糖為人參主要有效成分，人參皂苷具有保護和改善心肌缺血的作用[6]。

中藥復方的臨床運用多為湯劑，課題組前期通過綜合考慮參棗滴丸中各成分比例、性質和藥理作用，初步確定了參棗滴丸的提取工藝為水煎，本研究以丹酚酸B[7]77、沒食子酸[7]45和人參皂苷（Rg1、Re、Rb1）[7]8多組分指標作為評價標準，采用正交試驗方法對提取時間、加水倍數和提取次數進行考察，進一步優化參棗滴丸的提取工藝，為其后續研究開發提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC?20AT 高效液相色譜儀（日本島津株式會社）；SQP 電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；ME104 電子分析天平[梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司]；JJ500電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；KQ?300DZ 超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜級，瑞典Oceanpak公司）；超純水（屈臣氏集團）；冰乙酸（色譜級，上海麥克林生化科技有限公司）；磷酸（色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；正丁醇、95%乙醇、甲醇和NaOH（分析級，天津市致遠化學試劑有限公司）。

1.3 試藥

人參皂苷Rg1對照品（批號：110703?201832）、人參皂苷Re 對照品（批號：110754?201827）、人參皂苷Rb1對照品（批號：110704?201827）、丹酚酸B 對照品（批號：11562?201716）、沒食子酸對照品（批號：110831?201605）均購于中國食品藥品檢定研究院；丹參（批號：190101）、人參（批號：181202）、降香（批號：190201）均購于廣州至信藥業股份有限公司；廣棗（批號：190426）購于安徽亳州普潤藥業有限公司。

2 方法與結果

2.1 指標成分質量分數的測定

選擇丹酚酸B、沒食子酸和人參皂苷（Rg1、Re、Rb1）為指標成分，參考2020 年版《中國藥典》（一部），制定各成分質量分數的測定方法，并進行方法學驗證。結果表明，建立的有效成分HPLC 質量分數測定方法滿足檢測要求。

2.1.1 溶液的制備

供試品溶液的制備：按配方比例稱取廣棗、丹參、人參、降香藥材飲片，加6 倍量水煎煮30 min，過濾，加無水乙醇至70%進行醇沉，過濾，即得丹酚酸B 和沒食子酸供試品溶液。將此供試品溶液在60 ℃下旋干去除乙醇，加等量水溶解，等量水飽和正丁醇萃取4次，合并正丁醇層，用1%NaOH溶液洗滌2 次，用正丁醇飽和水洗滌3 次，過濾，濾液于60 ℃旋干，加甲醇定容至5 mL，即得人參皂苷測定用供試品溶液。

對照品溶液的制備：分別精密稱取丹酚酸B（8.130 mg）、沒食子酸（10.43 mg）和人參皂苷（Rg1、Re、Rb1分別為8.310、8.400、8.100 mg）對照品，置于10 mL量瓶中，分別加入80%甲醇、甲醇、甲醇溶解、定容，分別制成0.813 0 mg/mL 丹酚酸B 對照品溶液、1.043 0 mg/mL 的沒食子酸對照品溶液和人參皂苷混合對照品溶液（Rg1、Re、Rb1質量濃度分別為0.207 8、0.210 0、0.202 5 mg/mL）。

陰性樣品溶液的制備：除對照藥材外，按配方比例稱取其他藥材飲片，與供試品溶液同法制備，即得陰性樣品溶液。

2.1.2 色譜條件

丹酚酸B色譜條件：FeiniGen C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm），柱溫為20 ℃，流動相為乙腈?0.1%磷酸（體積比22∶78），檢測波長為286.0 nm，流速為1.2 mL/min，進樣量為10 μL。

沒食子酸色譜條件：FeiniGenXPeonyx AQ?C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm），柱溫為25 ℃，流動相為甲醇?0.3%冰乙酸（體積比1∶99），檢測波長為270.0 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL。

人參皂苷Rg1、Re 和Rb1色譜條件：Agela Tech?nologies Venusil XBP C18（L）色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm），柱溫為30 ℃，流動相為乙腈?0.1%磷酸（梯度洗脫，見表1），檢測波長為203.0 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL。

表1 人參皂苷梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution procedure of Ginsenoside

2.1.3 方法學驗證

2.1.3.1 專屬性試驗取各指標功效成分的對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各進樣10 μL，方法專屬性考察結果見圖1。可見，供試品在與對照品相應位置有對應色譜峰，陰性樣品無干擾；丹酚酸B、沒食子酸、人參皂苷（Rg1、Re、Rb1）基本上可達到基線分離，分離度＞1.5；理論塔板數以沒食子酸峰計應不低于3 000，以丹酚酸B 和人參皂苷Rg1峰計應不低于6 000；表明各方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of specificity test

2.1.3.2 線性范圍以“2.1.1”項對照品溶液為母液，稀釋制成一系列對照品溶液，吸取10 μL 進行液相分析。以質量濃度（mg/mL）為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，進行線性回歸分析。

精密吸取1、2、5、8、10、15 μL 丹酚酸B 對照品溶液進行分析，得丹酚酸B 線性回歸方程為y=10 007 958.67-43 931.23x，r=1.000，表明丹酚酸B對照品在0.813 0～12.20 μg 范圍內與峰面積呈良好線性關系。

取沒食子酸對照品溶液適量，加甲醇稀釋定容至10 mL，制成質量濃度分別為0.010 43、0.020 86、0.041 72、0.104 3、0.208 6 mg/mL 的一系列溶液，進樣分析，得線性回歸方程為y=30 039 004.20x，r=0.999 9，沒食子酸對照品在濃度0.010 43～0.208 6 mg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

精密量取人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照品溶液適量，加甲醇稀釋定容至10 mL，制成系列人參皂苷混合對照品溶液，其中，人參皂苷Rg1質量濃度梯度為0.053 20、0.106 3、0.265 8、0.531 5、0.850 4、1.063 mg/mL，人參皂苷Re質量濃度梯度為0.039 50、0.079 00、0.197 5、0.395 0、0.632 0、0.790 0 mg/mL，人參皂苷Rb1質量濃度梯度為0.040 60、0.081 10、0.202 8、0.405 5、0.648 8、0.811 0 mg/mL。得人參皂苷Rg1回歸方程y=3 494 935.74x，r=0.999 9；人參皂苷Re 回歸方程y=2 760 475.76x，r=0.999 9；人參皂苷Rb1回歸方程y=2 477 157.31x，r=0.999 9。表明人參皂苷Rg1、Re、Rb1分別在質量濃度0.053 20～1.063 mg/mL、0.039 50～0.790 0 mg/mL、0.040 55～0.811 0 mg/mL 范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.1.3.3 重復性試驗平行制備6 份供試品，精密吸取10 μL 進行液相分析，測得峰面積，求質量分數和RSD值。結果顯示丹酚酸B、沒食子酸、人參皂苷樣品的質量分數分別為24.9、0.97、2.6 mg/g，RSD 值分別為2.44%、1.17%和4.12%（n=6），表明方法重現性良好。

2.1.3.4 精密度試驗取已知濃度的供試品溶液，連續進樣3 d，每天1 次，記錄指標成分的峰面積和RSD 值。結果顯示，供試品丹酚酸B、沒食子酸、人參皂苷（Rg1、Re、Rb1）峰面積的RSD 值為1.05%、0.79%和1.23%（n=3），表明方法精密度良好。

2.1.3.5 穩定性試驗取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、10、12 h 進樣測定，記錄6 次進樣峰面積和RSD 值。結果顯示，丹酚酸B、沒食子酸、人參皂苷RSD值為0.47%、0.35%和2.04%（n=6），表明方法穩定性良好。

2.1.3.6 加樣回收試驗分別取含27 mg 丹參、60 mg 廣棗和657 mg 人參生藥量的供試品（n=6），對應精密加入丹酚酸B、沒食子酸、人參皂苷混合對照品溶液1 mL，加70%乙醇定容至5 mL，搖勻，過濾，精密吸取10 μL 進行液相分析，計算含量、加樣回收率及RSD 值（n=6）。結果顯示，丹酚酸B 平均加樣回收率為97.37%、RSD 值為3.01%，沒食子酸平均加樣回收率為100.8%、RSD 值為0.43%，人參皂苷（Rg1、Re、Rb1總量）的平均加樣回收率為91.31%、RSD值為1.60%，表明方法準確度良好。

2.2 正交試驗設計與結果

采用正交試驗優選參棗滴丸的水提工藝，按處方比例稱取廣棗50 g、人參33 g、丹參33 g、降香33 g，以廣棗中沒食子酸、丹參中丹酚酸B、人參中人參皂苷總含量（Rg1、Re、Rb1總量）為指標成分，以提取時間、加水倍數和提取次數為考察因素，采用L9（34）正交試驗表進行工藝考察，因素水平及試驗結果詳見表2-3。各指標評分權重分別為廣棗占0.4、丹參占0.3、人參占0.3，綜合評分（Y）=0.4（A-Amin）/（Amax-Amin）+0.3（B-Bmin）/（Bmax-Bmin）+0.3（C-Cmin）/（Cmax-Cmin），其中A 為沒食子酸質量分數、B 為丹酚酸B 質量分數、C 為人參皂苷Rg1、Re、Rb1總質量分數。方差分析見表4。

表2 因素水平表Table 2 Factor level table

可見，最佳工藝為A1B2C3，即煎煮時間30 min，8 倍量水，煎煮3 次；C（煎煮次數）對水提工藝的影響最大，但F 值小于F 臨界值，表明差異無統計學意義。由于3 個因素的影響均無統計學意義，從工業生產成本和能源節約的角度考慮，最終確定水提工藝為每個因素的初始水平，即：加6倍量水，煎煮2次，每次30 min。

2.3 工藝驗證試驗

為進一步驗證工藝的可行性和合理性，按處方比例稱取廣棗50 g、人參33 g、丹參33 g、降香33 g，以上述確定的最佳提取工藝條件（6 倍量水，煎煮2 次，煎煮時間30 min），平行試驗3 次，每組平行取2 份樣品進行檢測，檢測結果見表5。可見，水提液中的丹酚酸B、沒食子酸的質量分數和人參皂苷Rg1、Re、Rb1總質量分數基本穩定且與正交試驗數據基本吻合，表明該優選工藝條件可行。

3 討論

中藥復方成分復雜，作用方式多靶點、多層次[8]。若以單一成分指標進行工藝優選，不能保證中藥復方整體質量[9]；對指標成分進行合理的選擇和確定，是優選提取工藝的關鍵[10?11]。研究表明，廣棗中沒食子酸、丹參中丹酚酸B 以及人參中的人參皂苷Rg1、Re、Rb1等成分是治療心血管疾病的主要有效成分。因此，本研究選擇以上成分為指標成分，基于多組分指標和正交試驗對參棗滴丸有效成分的提取工藝進行優選，體現了中藥復方多成分的整體特點。

表3 參棗滴丸水提工藝的L9（34）正交試驗結果Table 3 The L9（34）orthogonal test results of the water extraction process of Shenzao Dropping Pills

表4 方差分析結果Table 4 The results of variance analysis

表5 最佳水提工藝驗證性試驗結果Table 5 Validation test results of the best water extraction process w/(mg·g-1)

本研究基于參棗滴丸方中君臣佐使的組方配伍規律，對廣棗中沒食子酸、丹參中丹酚酸B以及人參中的人參皂苷（Rg1、Re、Rb1）作為權重指標進行量化[9]。此方中，三味藥均為治療冠心病的要藥，廣棗為君藥，其權重系數設為0.4，丹參活血化瘀，人參大補元氣，二者在方中功效均較強，因此權重系數均設為0.3。正交試驗設計中，采用Hassan 法，對各指標成分進行歸一化處理，因三味藥組間指標差值較大，因此用最大最小歸一化公式進行計算，即di=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）[12]。

綜上，本研究優選的參棗滴丸水提工藝為：加6倍量水，煎煮2 次，每次30 min，經驗證合理可行，為參棗滴丸的質量控制和后續開發研究提供了依據和參考，并為研究中藥復方提取工藝的優化開拓了思路。