頸動脈斑塊超聲血管造影分級與病理微血管密度的相關性

何烜亞，陳兆耀，張 琳，劉 牛，李 輝

0 引 言

頸動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的常見病因，既往對于卒中風險的評估多集中在腦動脈狹窄程度以及臨床癥狀，但是對于無癥狀的患者僅憑狹窄程度無法為預測卒中風險提供充分的依據，對斑塊性質即斑塊易損性的評估對于減少動脈粥樣硬化性的腦卒中發生率、致殘率、死亡率具有重要意義[1]。目前關于“易損斑塊”(vulnerable plaque )的定義還是基于病理檢測結果，臨床上對于易損斑塊的診斷尚缺乏統一標準[2]。越來越多的證據表明，斑塊內新生血管(intraplaque neovascularization, IPN)與斑塊破裂出血、炎癥密切相關，是導致斑塊生長和易損的重要因素[3,4]。因此，臨床上準確地識別斑塊內新生血管，有助于易損斑塊的識別與診斷，對于指導心腦血管疾病的預防有著重要的意義。

頸動脈血管彩超由于其無創性與快捷性是目前臨床最常用的辨別頸動脈易損斑塊的臨床方法，但是檢查結果有時依賴檢查者的主觀判斷與操作時超聲探頭的角度、方向與位置，特異性較差。超聲血管造影(contrast-enhanced ultrasound, CEUS)是識別頸動脈斑塊內新生血管的超聲新技術，其利用發射聲波與造影劑微氣泡諧振所產生的二次諧波信號進行成像，能敏感獲取斑塊內微小血管的灌注特征[5]。本研究擬通過對比頸動脈粥樣硬化斑塊CEUS分級與斑塊病理標本新生血管密度，確認CEUS識別斑塊內新生血管的準確性。

1 資料與方法

1.1 一般資料前瞻性入組2017年11月至2019年12月在南京市鼓樓醫院的神經外科接受頸動脈內膜剝脫術(carotid endarterectomy,CEA)的患者，手術適應證為狹窄程度>70%無癥狀或有癥狀的頸動脈粥樣硬化。如果患者曾經出現過缺血性中風或短暫腦缺血發作，則被定義為有癥狀的頸動脈粥樣硬化。排除標準：感染和(或)敗血癥、高凝狀態和(或)近期的血栓栓塞以及嚴重肝、腎功能障礙以及對超聲造影劑過敏患者。所有患者術前至江蘇省中醫院超聲醫學科行頸動脈CEUS檢查并記錄檢查結果，檢查后1周內行CEA。共入組20例患者，其中17例為有癥狀患者，3例為無癥狀患者。本研究經江蘇省中醫院倫理委員會批準(批準號：2017NL-004-02)，符合《赫爾辛基醫學研究倫理原則宣言》，所有患者均給予書面知情同意參與。

1.2 頸動脈斑塊CEUS檢查傳統頸動脈超聲和CEUS是使用配有L9-3換能器的Philips iU-22超聲儀(美國博塞爾的Philips Medical Systems)進行的。使用對比度為70%的特定于對比度的軟件設置。頸動脈成像是由2名經驗豐富的超聲醫師根據美國超聲心動圖學會共識聲明使用標準的掃描方案進行[6]?；颊哐雠P姿勢，該姿勢朝向檢查的對側，并露出脖子。B型和彩色多普勒超聲分別在左右方向上掃描左右頸總動脈、頸總叉、頸內動脈、頸外動脈和椎動脈[7]。充分評估所有斑塊，并記錄頸動脈狹窄程度。

在常規頸動脈超聲檢查之后，利用第二代回聲造影劑(Bracco，米蘭，意大利)進行CEUS，該造影劑由磷脂穩定的六氟化硫微泡組成。靜脈通道首先用5 mL等滲鹽水沖洗，然后向左肘淺靜脈注射1.2 mL造影劑，然后立即予以5 mL的0.9%NaCl等滲鹽水沖洗。內置定時裝置和圖像采集同步啟動。在CEUS檢查期間，探頭聚焦于先前已確定目標斑塊部位，并在低聲壓下通過縱向掃描完成圖像采集。

注射微泡后約15 min內，頸動脈腔內可觀察到增強的對比效果，持續時間約5 min。如果檢測到多個斑塊，則患者可以重復接受以上檢查操作，2次檢查之間的間隔時間必須超過15 min。如果檢測到噬菌斑，則將靜止幀和片段以數字方式存儲至少10 min以進行進一步分析。為了降低噪聲并獲得均勻的信號強度，我們調制了時間增益補償。采用0.06的機械指數，并且在測試過程中焦點位于屏幕的底部，以減少微氣泡的破壞。同時，將幀頻和圖像深度分別調制為12/s和3～5 cm，以適應頸動脈的直徑。前面提到的所有設置在每次檢查中都保持不變。

CEUS斑塊分級：①0級：斑塊內未見增強回聲；②1級：斑塊內小范圍點樣增強回聲；③2級：點狀、短線樣增強回聲；④3級：斑塊內長線樣或網狀增強回聲。CEUS易損斑塊標準：其中0～1級為穩定斑塊，2～3級為不穩定斑塊。

1.3 頸動脈內膜剝脫術(CEA)手術在全麻下進行。患者取仰臥位，肩部墊高、頭偏向對側，切口位于胸鎖乳突肌前緣，以頸動脈分叉為中心稍靠上，長5～7 cm。斜行切開皮膚及頸闊肌，乳突撐開器及兩把甲狀腺拉鉤牽開切口。銳性分離頸深筋膜至頸動脈鞘，雙重結扎面總靜脈，充分解剖暴露頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈遠心段。全身肝素化、基礎血壓升高15%后分別阻斷頸內動脈、頸總動脈、頸外動脈，測頸內動脈殘端壓?？v行切開頸內動脈、頸總動脈。專用神經剝離子剝脫斑塊，圈鑷摘除殘留斑塊。分別縫合內膜及頸動脈壁，吻合完畢后開放阻斷的動脈，基礎血壓降低15%。檢查吻合口徹底止血，放置負壓引流管，全層連續稀松縫合頸闊肌和皮膚。

1.4 斑塊組織學檢查行頸動脈內膜剝脫術后，取出的斑塊用等滲鹽水沖洗，經4%甲醛溶液固定、24 h脫鈣處理并石蠟包埋后連續切片(3～5 μm)。行HE染色及CD31單克隆抗體免疫組化(IHC)染色。HE染色觀察斑塊內組織成分及血管。CD31是內皮細胞間連接的組成部分，CD31單克隆抗體免疫組化染色標記新生血管，鏡下觀察，40倍低倍鏡下選3～5個血管豐富的熱點區域，轉至200倍和400倍高倍鏡下進行計數取均值，通過Image-Pro Plus(IPP)圖像分析軟件進行微血管密度(MVD)定量分析。

2 結 果

2.1 患者基線數據20例患者中，男18例，女2例，高血壓病史13例(85%)，糖尿病病史5例(25%)，腦梗死病史17例(85%)，冠心病病史3例(15%)，外周血管病病史8例(40%)，吸煙病史5例(25%)，長期飲酒史2例(10%)。年齡(64.9±7.1)歲，身高(168.80±7.48)cm，體重(71.11±11.48)kg，收縮壓(142.53±10.90)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，舒張壓(80.16±12.24)mmHg，總膽固醇(3.85±0.83)mmol/L，三酰甘油(1.73±0.82)mmol/L，低密度脂蛋白(1.73±0.83)mmol/L，高密度脂蛋白(1.15±0.37)mmol/L，C反應蛋白(80.12±96.45)mg/l，天冬氨酸轉移酶(27.67±23.77)U/L，丙氨酸轉移酶(34.83±41.40)U/L，肌酸激酶(99.71±61.27)U/L，血肌酐(67.92±14.25)μmol/L，尿素氮(5.23±1.72)mmol/L。

2.2 斑塊病理標本HE染色及CD31單克隆抗體的免疫組化染色HE染色可以見到斑塊內新生血管，并且在血管周圍可以見到大量的紅細胞，提示斑塊內存在出血。CD31單克隆抗體的免疫組化染色(IHC)中，藍色為細胞核，黃色、棕黃色或有黃色棕色顆粒是CD31免疫組化陽性反應，標記為血管內皮細胞，并顯示了斑塊內新生血管形態。見圖1。

a、b：斑塊HE染色(a:100倍，b:200倍)，黑色箭頭示斑塊內新生血管；c、d：斑塊CD31標記的IHC(c:200倍，d:400倍)，黑色箭頭示斑塊內新生血管圖1 頸動脈粥樣硬化斑塊HE染色及CD31單克隆抗體免疫組化(IHC)染色

2.3 CEUS新生血管分級與斑塊組織切片MVD相關性分析20例患者CEUS成像檢測20個目標斑塊內的新生血管，按照0～3級的分級標準，其中1級2個(10%)，2級7個(35%)，3級11個(55%)。CD31免疫組化染色200倍高倍鏡下MVD為(9.37±3.56)條/mm2。Spearman相關性分析顯示CEUS新生血管分級與CD31免疫組化染色200倍高倍鏡下組織切片MVD呈正相關(r=0.662，P=0.001)。

3 討 論

易損斑塊定義主要依賴斑塊的病理特征，如薄的纖維帽、大的壞死核心、膽固醇沉積以及斑塊內炎癥等[8]。IPN是對動脈內膜增厚及斑塊中需氧量增加的保護性生理反應，起始階期分為芽生和管腔形成，隨后血管內皮生長因子(VEGF)表達的下調和內皮中血管生成因子-1(Ang-1)、血小板衍生因子 (PDGF)、轉化生長因子-β1 (TGF-β1)等的升高介導新生血管消退的過程[9]。生理性新生血管的生成維持了斑塊內的氧供，避免了斑塊內細胞的壞死和凋亡。但是病理性新生血管大量生成成為循環中炎癥細胞及炎癥介質流入斑塊的主要途徑，加劇斑塊內炎癥、脂質核心的擴張、氧化損傷和蛋白酶活化，促進斑塊生長。大量不成熟的IPN由于嚴重的結構和功能異常，可以誘導斑塊內出血(intra-plaque hemorrhage, IPH)及斑塊破裂，導致各種心腦血管事件的發生[10]。所以，IPN是動脈粥樣硬化斑塊發展的特征，也是動脈粥樣斑塊穩定性的核心標志[11]。本研究中，患者手術切除斑塊HE染色中可以檢測到了大量的新生血管，證實斑塊內存在大量新生血管生成，在血管周圍發現大量紅細胞，則提示可能存在新生血管破裂導致了IPH。通過CD31標記的IHC染色，進一步確認斑塊內存在大量的新生血管生成。

IPN對于斑塊生長及易損性的起到決定性作用，所以臨床上對IPN的準確識別是臨床診斷易損斑塊的重要組成部分。目前診斷頸動脈易損斑塊的方法有數字減影血管造影(DSA)、CT動脈成像(CTA)、磁共振(MR)血管成像成像等。DSA可以準確診斷動脈硬化血管狹窄程度以及斑塊表面形態，是易損斑塊重要診斷方法，然而，DSA不能觀察到斑塊內部結構，雖然血管內超聲 (IVUS)[12]及光學相干斷層掃描 (OCT)[13]血管內成像方法在一定程度上彌補了這個缺陷，但是其仍然不能準確顯示IPN，另外，由于其有創性及價格高昂使得應用受到限制，臨床上不作為常規篩查項目。CTA對血管狹窄以及鈣化有著良好的識別，但是對于血管壁及斑塊內部組織成分的識別準確性不高[14]。DSA以及CTA均使用含碘造影劑，較高的過敏率以及腎毒性也限制了兩者在臨床上的使用。MR血管成像可以直接觀察血管管壁及斑塊內部結構，通過增強劑的作用可以識別斑塊內強化，可以有效且準確診斷易損斑塊，且可以檢查顱內血管，如大腦中動脈，在易損斑塊的診斷方面是僅次于病理診斷的準金標準[15]。但是，MRI由于檢測時間時間較長，受呼吸及運動偽影影響大，成功率僅有70%左右。另外，MRI分辨率均在0.2～1 mm，不能完全滿足纖維帽厚度測量和斑塊內組分成像的要求。同時，檢測的準確性容易受到磁共振磁場、線圈及技師操作的干擾，導致準確性下降，且檢查費用較高，這些也限制了其臨床上應用。

利用斑塊內新血管對造影劑微泡的攝取，CEUS可提供高時空分辨率的血管造影樣圖像，以動態可視化頸動脈斑塊的新血管形成。本研究通過與病理學CD31染色標記的血管比較，發現CEUS檢測新生血管分級與病理檢測斑塊內微血管密度有很好的相關性，證實CEUS技術可以精準識別頸動脈粥樣硬化斑塊中新生血管數量，通過新生血管數量的分級可以準確診斷易損斑塊，與既往國內外研究結果一致[16-19]。與MR斑塊增強成像及CTA相比，CEUS可以提供連續、動態、實時斑塊內血管成像，不易遺漏某個增強階段[20]。除了可以準確識別斑塊內新生生血管，CEUS可以在彩色多普勒超聲(CDUS)的基礎上改善頸動脈狹窄分級的準確性和斑塊特征(如表面潰瘍)的檢測[21]。此外，CEUS技術作為一種非侵入性、無創傷性的影像檢查方法，還具有價格優勢、便攜性、可重復性以及更少禁忌證的特點。

總之，CEUS技術可以安全、可靠地識別頸動脈粥樣硬化斑塊中的新生血管，準確診斷易損斑塊。CEUS未來還可用于監測頸動脈易損斑塊的治療療效，并對指導腦卒中的二級甚至一級預防有著重要的臨床意義。

本研究樣本量較小，未來需要通過更大樣本量或動物實驗的研究進一步證實相關結果。另外，CEUS斑塊易損性分級依賴檢測到斑塊內的造影劑增強情況，并未帶入其他斑塊的特征，如斑塊斑塊表面潰瘍及內部信號特點等，未來應進一步探索基于CEUS檢測全部內容的臨床易損斑塊診斷分級標準。