超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定小麥中黃曲霉毒素B1

高曉芳，胡婷婷，洪 冰，弓浩然，鄭婷婷，董磅礴，蘇淼冉

（鄭州市糧食科學研究所，河南 鄭州 450001）

小麥在儲存過程中因儲存方式不當會導致黃曲霉毒素污染[1]。據報道[2]，溫度30 ℃、相對濕度80%、谷物水分在14% 以上的條件最適合黃曲霉繁殖和生長，并且在24～34 ℃，黃曲霉的產毒量最高。研究表明，黃曲霉毒素具有肝臟毒性[3-4]，并且具有免疫抑制作用[5]，是一種能夠致癌、致畸、致突變的真菌毒素，被世界衛生組織（WHO）癌癥研究機構確定為1A類致癌物，受到了全世界各個國家的廣泛關注[6-7]。目前報道的黃曲霉毒素有20多種，其中黃曲霉毒素B1最為常見。為了保障谷物及其制品的安全，國際食品法典委員會（CAC）、歐盟、美國等均制定了糧食中真菌毒素限量標準[8]，我國也在GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》中對黃曲霉毒素的限量標準作了明確的規定，每1 kg小麥中黃曲霉毒素B1不得超過5 μg[9]。目前，GB 5009.22—2016推薦的黃曲霉檢測方法主要有同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜-柱前衍生法、高效液相色譜-柱后衍生法和酶聯免疫吸附法。其中，高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD法）是最常用的方法[10-11]，但此方法操作比較繁瑣，并且耗時長。本文采用同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法對黃曲霉毒素B1進行檢測，并且對直接稀釋法和免疫親和柱純化法兩種前處理方法的檢測結果進行比較，以期建立一種快捷、便利的同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法檢測黃曲霉毒素B1的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

I-Class/XEVO TQ-S型超高液相色譜儀-三重串聯四級桿質譜儀聯用儀：WATERS公司；MLI104型水分磨：法國Chopin公司；PL-2002型電子天平（1/100）：瑞士梅特勒-托利多公司；TGL-10C型高速臺式離心機：上海市安亭電子儀器廠。

1.2 樣品

小麥：鄭州市庫存小麥。

1.3 試劑

黃曲霉毒素B1標準品（純度≥98%）：農業農村部環境保護科研監測所；同位素內標13C17-黃曲霉毒素B1（純度≥98%）：壇墨質檢科技股份有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：美國默克公司；乙酸銨（色譜純）、甲酸（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.4 溶液制備

1.4.1 標準溶液配置

（1）中間標準工作液：取適量黃曲霉毒素B1母液（2 μg/mL），用甲醇稀釋，得到質量濃度為100 ng/mL的黃曲霉毒素B1中間標準工作液。

（2）同位素內標工作液：取適量同位素內標13C17-黃曲霉毒素B1（0.5 μg/mL），用甲醇稀釋至100 ng/mL。

（3）標準系列工作溶液：準確移取黃曲霉毒素 B1中間標準工作液（100 ng/mL） 10、50、100、200、500、800、1 000 μL至10 mL容量瓶中，加入200 μL 100 ng/mL的同位素內標工作液，用初始流動相定容至刻度，配制質量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 ng/mL的系列標準溶液。

1.4.2 待測樣品溶液制備

取樣量1 kg，用高速粉碎機將其粉碎，過篩（粒徑小于2 mm）。稱取5 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入100 μL同位素內標工作液，振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 mL乙腈—水溶液（84+16），置于渦旋振蕩器中振20 min，6 000 r/min離心10 min，玻璃纖維濾紙過濾，取上清液備用。

1.5 試樣的凈化

準確移取4 mL上清液，加入46 mL水，混勻，上免疫親和柱，用2×10 mL水淋洗柱子，然后用1 mL甲醇洗脫親和柱，收集全部洗脫液至試管中，并在50 ℃下氮吹至近干，加入1.0 mL初始流動相，渦旋1 min溶解殘留物，0.22 μm有機濾膜過濾后上機。

1.6 超高效液相色譜-串聯質譜條件的選擇及優化

1.6.1 液相色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×50 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：鹽溶液（A），含0.1%甲酸的4.0 mmol/L乙酸銨溶液，甲醇（B）；流速：0.3 mL / min；進樣量：5 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 UPLC梯度洗脫程序

1.6.2 質譜條件

（1） 離子源控制條件：離子源為電噴霧離子源（ESI）；檢測方式為ESI+，MRM多反應監測模式；毛細管電壓2.5 kV；錐孔電壓40 V；離子源溫度150 ℃；錐孔反吹氣流量150 L/h；霧化氣溫度450 ℃；質譜接口溫度（HSID）280 ℃。

（2） 離子參數優化：將黃曲霉毒素B1的標準儲備液用甲醇稀釋定容至1 μg/mL，通過色譜柱-質譜進樣法，分別評估正、負離子模式下黃曲霉毒素B1的電離情況。結果顯示，在正離子模式下，黃曲霉毒素B1有較好的響應，并采用正離子模式優化質譜條件參數，參數優化結果見表2。

表2 離子選擇參數表

2 結果與分析

2.1 相關系數和線性范圍檢測

配置質量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 ng/mL的黃曲霉毒素B1系列標準溶液，在確定的液質聯用檢測條件下進行測定，在1.72 min時檢測到目標峰，總離子色譜圖見圖1。以黃曲霉毒素B1色譜峰與13C17-黃曲霉毒素 B1色譜峰的峰面積比值為縱坐標，黃曲霉毒素 B1質量濃度為橫坐標進行線性回歸。實驗結果表明，黃曲霉毒素B1在0.1～10.0 ng/mL的質量濃度范圍內線性關系良好，線性方程：If=1.777c + 0.005 23，其相關系數R2為0.999 7，標準曲線見圖2。

圖1 總離子色譜圖

圖2 標準曲線

2.2 檢出限和定量限

將空白小麥樣品獨立測試10次，樣品空白平均值加上3倍的標準偏差確定方法的檢出限（LOD）為0.004 μg/kg，樣品空白平均值加上10倍的標準偏差確定方法的定量限（LOQ）為0.01 μg/kg。檢出限與定量限均小于標準規定的檢出限與定量限要求，能夠滿足小麥中黃曲霉毒素B1的檢測要求[12]。

2.3 精密度和正確度(回收率)

選取不含黃曲霉毒素B1的小麥樣品進行精密度和加標實驗，分別在空白樣品中添加不同濃度的標準溶液，使黃曲霉毒素B1最終濃度分別為0.1、4.5、9.0 μg/kg，在同樣 的 液 質聯用檢測條件下進行測定。其相對標準偏差和回收率結果見表3。由表3可知，3個濃度水平的相對標準偏差為0.30%～11.50%，加標回收率為91.7%～100.9%，符合GB/T 27404附錄F的要求。

表3 小麥中黃曲霉毒素B1的相對標準偏差和加標回收率

2.4 直接稀釋法和免疫親和柱純化法對檢測結果的影響

考慮到免疫親和純化法耗時長、費用高，且小麥基質中物質比較單一，雜質少、干擾少的特點，在前處理中，采用將提取液直接稀釋后上機檢測的方法，即準確轉移4 mL提取液于另一15 mL離心管中，加入4 mL水，渦旋混勻后，6 000 r/min離心5 min，吸取上清液過0.22 μm有機濾膜后上機檢測，并對兩種前處理方法的結果進行比較，結果見表4。由此可知，直接稀釋法檢測結果的精密度為3.49%，回收率為93.8%，免疫親和柱純化法檢測結果的精密度為3.10%，回收率為92.2%，采用兩種不同前處理方法的檢測結果均符合GB/T 27404附錄F的要求。

表4 兩種前處理方法的檢測結果比較

直接稀釋法相較于免疫親和柱純化法更節省時間，節約成本，且減少了前處理過程中目標化合物的損失，因此直接稀釋法更適合大批量樣品的檢測。

3 結 論

本實驗基于GB 5009.22—2016中黃曲霉毒素B1檢測方法——同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法，并對樣品的前處理方法、色譜及質譜條件作了優化，建立了快速準確定量分析小麥中黃曲霉毒素B1的同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法。還考察了該方法的相關系數和線性范圍，檢測了方法的檢出限和定量限，并通過加標回收試驗檢測了方法的精密度和準確度，結果均符合GB/T 27404附錄F的要求，滿足實驗室快速、準確定量分析大批量小麥中黃曲霉毒素B1的檢測需求。