時間分辨熒光免疫層析法同時定量檢測糧食中玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素

張少波，鄧常繼，張海濤，朱啟思

（1. 廣東省糧食和物資儲備保障中心，廣東 廣州 510050；2. 廣東省糧食科學研究所，廣東 廣州 510050；3. 江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇 無錫 214000）

糧食在生產(chǎn)、貯存、運輸?shù)冗^程中，受氣候、季節(jié)、加工不當?shù)纫蛩赜绊懀瑯O易發(fā)生霉變而產(chǎn)生霉菌毒素[1]。全球每年約有25%的糧食受到霉菌毒素的污染，造成的經(jīng)濟損失達數(shù)千億美元[2]。我國同樣遭受嚴重的霉菌毒素污染問題，每年因此造成的糧食損失高達110億kg[3]。更為嚴重的是，霉菌毒素可通過飼料或食品進入人和動物體內(nèi)導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多系統(tǒng)器官的損傷[4]。

霉菌毒素種類繁多，其中玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）和嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）是糧食中最常見的2種霉菌毒素。玉米赤霉烯酮又稱F-2毒素，主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生[5]，具有生殖發(fā)育毒性、免疫毒性和基因毒性[6]，被FAO和WHO確定為最危險的自然發(fā)生的食品污染物之一。嘔吐毒素又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，主要由鐮刀菌屬產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，具有很強的免疫抑制和細胞毒性，被歐盟列為三級致癌物[7]。近年來，ZEN和DON超標事件屢見報道，引起社會廣泛關(guān)注。受霉菌毒素污染的糧食尚無有效的去毒方法，因此，加強糧食中霉菌毒素的監(jiān)測成為降低其危害的重要途徑。時間分辨熒光免疫層析技術(shù)因其靈敏度高、檢測速度快、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點，成為霉菌毒素檢測領(lǐng)域的研究熱點，并在食品檢測行業(yè)得到應用[8]。

時間分辨熒光免疫分析法是一種微量分析方法，利用免疫反應的高度特異性和標記示蹤物的高度靈敏性相結(jié)合而建立的一類非放射性的檢測技術(shù)，是目前最靈敏的超微量分析技術(shù)之一[9]。目前，該技術(shù)的應用主要集中在單個霉菌毒素的快速定量檢測，多種毒素特別是ZEN、DON的同時檢測報道較少。本文擬建立同時測定糧食中ZEN和DON含量的時間分辨熒光免疫層析定量檢測方法，為其進一步推廣使用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

SW-2型時間分辨熒光免疫層析定量檢測儀、ZEN和DON時間分辨熒光免疫層析定量檢測卡：江蘇省蘇微微生物研究有限公司；AL204-IC型電子天平：梅特勒-托利多國際股份有限公司；3310型盤式實驗粉碎磨：波通瑞華科學儀器有限公司；Multi Reax型旋渦混勻器：德國Heidolph公司；MINI-7K型微型離心機：杭州米歐儀器有限公司；Milli-Q型超純水儀：美國密理博公司；20 ~ 200 μL和100 ~ 1 000 μL單道可調(diào)移液器：德國Eppendorf公司。

甲醇、乙腈：色譜純，德國Merck公司；ZEN、DON免疫親和柱、樣品稀釋液：江蘇省蘇微微生物有限公司；玉米全粉中嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮成分分析標準物質(zhì)[GBW（E）100383]、全麥粉中玉米赤霉烯酮成分分析標準物質(zhì)[GBW（E）100384]、糙米粉中嘔吐毒素成分分析標準物質(zhì)[GBW（E）100608]、ZEN標準品[GBW（E）100301]及DON標準品[GBW（E）100304]：國家糧食和物資儲備局科學研究院。

1.2 試驗方法

1.2.1 檢測原理

玉米赤霉烯酮/嘔吐毒素時間分辨熒光免疫層析定量檢測二聯(lián)卡運用競爭抑制免疫層析的原理，樣本中若含有ZEN、DON，則在側(cè)向移動的過程中會與熒光微球標記的特異性單克隆抗體反應，抑制抗體和NC膜檢測線上ZEN-BSA與DON-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合。隨著樣本中ZEN與DON含量的升高，結(jié)合于檢測線上的抗體量減少，相應的檢測線熒光強度也隨之變?nèi)酢Ｊ褂脤Ｓ脮r間分辨熒光免疫層析檢測儀讀數(shù)，可定量地測出樣本中ZEN與DON的含量。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取2.00 g粉碎樣品（稻谷樣品需壟谷）于50 mL離心管中，加入10 mL 60%甲醇水至50 mL離心管中，渦旋提取2 min，7 000 r/min離心5 min，取上清液。

1.2.3 樣品檢測

測試前，將未開封的檢測卡及試劑平衡至25 ℃。將檢測卡平放，用移液器定量吸取100 μL上清液加入500 μL樣本稀釋液，反復吸打5次以充分混勻，吸取100 μL此混合液垂直滴加于加樣孔中，于20 ~ 25 ℃下反應10 min后，將檢測卡放入時間分辨熒光免疫層析檢測儀中檢測；在儀器感應區(qū)中放置對應的標準曲線智能卡，在主界面的“測量”菜單中點擊讀取智能卡后，點擊“樣品測量”進行檢測儀器讀數(shù)完成后會自動計算出被檢樣本中的ZEN和DON含量，可選擇儲存及打印結(jié)果。

若環(huán)境溫度不在20 ~ 25 ℃范圍內(nèi)，則需在測樣前進行一次校準，即取100 μL DON-ZEN標準溶液點卡反應10 min，再將此卡放入儀器中，在儀器主界面的“測量”菜單中點擊“標準測量”按鈕，進行校準；若環(huán)境溫度在該范圍內(nèi)，則無需校準。

1.2.4 檢測方法的評價

（1）線性范圍與定量曲線：DON標準品與ZEN標準品用50%甲醇定容配制成1 000 ng/mL的標準儲備溶液；采用0.4%的吐溫-PBS（pH 7.2，0.01 mol/L）稀釋成0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL的標準工作溶液。分別取100 μL加至層析卡的樣品孔中，每個濃度設(shè)置3個平行，由低濃度到高濃度進行檢測，記錄時間分辨熒光儀檢測T1、T2線熒光強度與C線熒光強度，計算T1/C與T2/C值。以標準工作溶液濃度的自然對數(shù)值（InC）為橫坐標，以各濃度標準液的T/C值與0 ng/mL標準液的T0/C0值的比值所得百分比為縱坐標，制圖、選擇線性范圍，并建立定量曲線。

（2）檢出限與定量限：取20組獨立的陰性玉米樣品（ZEN、DON均未檢出），用玉米赤霉烯酮/嘔吐毒素時間分辨熒光免疫層析二聯(lián)卡對其進行檢測。檢出限（LOD）等于20次測定結(jié)果的均值（）加上3倍的標準標準差（s），即＋3s；定量限（LOQ）等于＋10s。

（3）準確度：按照1.2.2的前處理方法，在陰性玉米或小麥樣品中分別加入低、中、高濃度的ZEN/DON標準溶液，測定加標回收率，評估方法的準確度。

（4）精密度：分別選擇接近于方法定量限、標準最高允許限量和本方法線性范圍內(nèi)適當含量水平的3種濃度的ZEN-DON標準工作溶液，每個濃度水平10次重復試驗，計算批內(nèi)變異系數(shù)（CV）。

（5）批間穩(wěn)定性：采用接近于標準最高允許限量的ZEN-DON標準工作溶液，測試10個批次的二聯(lián)卡，每個批次測定3次，批內(nèi)測定取平均值，計算二聯(lián)卡批間變異系數(shù)。

（6）與液相色譜法的對比試驗：取不同基質(zhì)不同濃度的標準物質(zhì)，先用液相色譜法測定，再使用時間分辨熒光免疫層析法測定，并對比驗證。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍與定量曲線

由圖1、圖2可以發(fā)現(xiàn)，橫坐標采用的是濃度的自然對數(shù)，通過繪制得到的依然是平滑的S曲線，這與免疫競爭得到的曲線是一致的。同時，DON在0.5 ~ 50.0 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，該段曲線接近于直線，分析其線性回歸相關(guān)系數(shù)R2= 0.990 1；ZEN在0.2 ~ 5.0 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，同樣為一段接近于直線的曲線，分析其線性回歸相關(guān)系數(shù)R2= 0.992 2。由此，選定DON定量曲線的線性范圍為0.5 ~ 50.0 ng/mL，ZEN定量曲線的線性范圍為0.2 ~ 5.0 ng/mL，并以此作為以下試驗的線性濃度，建立定量曲線如圖3、圖4所示。

圖1 不同濃度DON標準工作溶液（0.2～50.0 ng/mL）的平滑曲線

圖2 不同濃度ZEN標準工作溶液（0.2～50.0 ng/mL）的滑曲線

圖3 DON定量曲線

圖4 ZEN定量曲線

2.2 檢出限和定量限

由表1可知，ZEN的檢出限和定量限分別為7.92、15.10 μg/kg，DON的檢出限和定量限分別為71.9、146.1 μg/kg，滿足GB 2761—2017規(guī)定的糧食樣品ZEN、DON的限量要求。

表1 方法的檢出限和定量限（n=20） μg/kg

2.3 準確度

根據(jù)GB 2761—2017標準限量，設(shè)定3個涵蓋低、中、高濃度的加標回收試驗，其中ZEN加標濃度分別為30、60、120 μg/kg，DON加標濃度分別為500、1 000、1 500 μg/kg，用二聯(lián)卡重復測定6次，結(jié)果如表2、表3所示。可知，本方法加標回收率在91% ~ 106%，相對標準偏差小于15%，滿足檢驗的要求。

表2 ZEN加標回收率試驗結(jié)果

表3 DON加標回收率試驗結(jié)果

2.4 精密度

參照LS/T 6112—2015附錄A的方法，配置3種濃度的ZEN/DON標準工作溶液，每個濃度水平重復測定10次，計算二聯(lián)卡批內(nèi)變異系數(shù)，結(jié)果見表4、表5。可知，ZEN批內(nèi)變異系數(shù)在8.02% ~ 12.53%，DON批內(nèi)變異系數(shù)在7.11% ~ 14.03%，均小于20%，說明該方法精密度良好。

表4 ZEN精密度試驗結(jié)果（n=10）

表5 DON精密度試驗結(jié)果（n=10）

2.5 批間穩(wěn)定性

配置ZEN/DON標準工作溶液，按1.2.4（5）進行測試，結(jié)果表明（表6），ZEN批間變異系數(shù)為13.53%，DON批間變異系數(shù)為11.17%，均小于20%，說明該方法批間差異不大，穩(wěn)定性良好。

表6 批間穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n=10）

2.6 與液相色譜法的對比試驗

分別采用液相色譜法和時間分辨熒光免疫層析法檢測玉米全粉中嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮成分分析標準物質(zhì)、全麥粉中玉米赤霉烯酮成分分析標準物質(zhì)、糙米粉中嘔吐毒素成分分析標準物質(zhì)，重復測定5次，將兩種方法的檢測結(jié)果進行線性回歸分析，結(jié)果如圖5、圖6所示。兩種方法的ZEN和DON檢測結(jié)果線性回歸系數(shù)（R2）分別為0.991 5和0.990 5，且所測結(jié)果均在標準物質(zhì)的標準值內(nèi)。說明在不同的糧食基質(zhì)中，時間分辨熒光免疫層析法檢測值與液相色譜法檢測值較為一致，結(jié)果準確有效。

圖5 HPLC法與時間分辨熒光免疫層析法測定ZEN的相關(guān)性

圖6 HPLC法與時間分辨熒光免疫層析法測定DON的相關(guān)性

3 結(jié) 論

本試驗建立了同時測定糧食中ZEN和DON含量的時間分辨熒光免疫層析定量檢測方法。該法對糧食中ZEN、DON的檢出限分別為7.92、71.90 μg/kg，定量限為15.10、146.10 μg/kg，線性范圍為0.2 ~ 5.0、0.5 ~ 50.0 ng/mL，不同水平的加標回收率在91% ~ 106%，批內(nèi)與批間變異系數(shù)均小于20%。選取不同基質(zhì)的標準質(zhì)控樣品進行測試，本試驗建立的方法與液相色譜法檢測結(jié)果具有較好的相關(guān)性，且在所測標準質(zhì)控樣品的標準值范圍內(nèi)。該方法的準確度和精密度滿足使用要求，且具有簡便、快速、經(jīng)濟等特點，適用于玉米、小麥、稻谷等糧食的ZEN和DON快速定量檢測。