‘陽光玫瑰’葡萄皺葉花葉癥狀嫁接傳染研究

白先進(jìn)，婁兵海*，韓佳宇，王博，宋雅琴，白揚(yáng)，曹雄軍，成果

（1. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西南寧 530007；2. 廣西特色作物研究院，廣西桂林 541004；3. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530005；4. 廣西真誠農(nóng)業(yè)有限公司，廣西南寧 530007）

葡萄（Vitis viniferaL.）是世界上重要的水果之一，面積和產(chǎn)量均居全球水果第二位。據(jù)OIV統(tǒng)計(jì)，2020年全球葡萄栽培面積約730萬 hm2，中國葡萄面積78.5萬 hm2，全球占比10.7%，位列第三。但葡萄也是果樹中感染病毒最多的樹種之一，其病毒種類之多、分布之廣、危害之大備受世界關(guān)注，目前在葡萄上發(fā)現(xiàn)的病毒已有80種[1]。由于葡萄苗木擴(kuò)繁中長期采用扦插、嫁接等營養(yǎng)繁殖方法，使得葡萄病毒類病害在我國廣泛流行，造成產(chǎn)量減少、品質(zhì)降低，甚至存在毀園的風(fēng)險。

‘陽光玫瑰’是近年引入我國的優(yōu)新葡萄品種，但在春季新梢旺長期普遍出現(xiàn)皺縮畸形、斑駁、小葉癥狀（圖1），從而導(dǎo)致植株樹勢衰弱、結(jié)實(shí)力降低，并且小苗難以成園。本團(tuán)隊(duì)前期的研究證明上述現(xiàn)象與病毒侵染有關(guān)[2-3]。鑒于‘陽光玫瑰’葡萄的優(yōu)良品質(zhì)，近幾年已有大面積的種植，且未來還有推廣潛力，因此病毒病的傳播問題應(yīng)該得到足夠重視。本研究擬通過嫁接試驗(yàn)進(jìn)一步明確‘陽光玫瑰’上出現(xiàn)的皺葉、花葉癥狀是否為病毒感染，從而為‘陽光玫瑰’葡萄病毒病防控提供理論依據(jù)。

圖1 ‘陽光玫瑰’葡萄葉片皺縮、畸形、斑駁癥狀Figure 1 Leaf crinkle, misshapen and mosaic symptoms on'Shine Muscat' grapevines

1 材料和方法

1.1 植物材料

供試植物：帶毒‘陽光玫瑰’葡萄植株采自廣西南寧市武鳴區(qū)廣西真誠農(nóng)業(yè)有限公司種植園及網(wǎng)室保存的單株；脫毒‘陽光玫瑰’葡萄植株栽植于無病母本園網(wǎng)棚。

1.2 試劑及儀器

參照已報道的文獻(xiàn)，分別合成葡萄卷葉伴隨病毒1（Grapevine leafroll-associated virus-1，GLRaV-1）、葡萄卷葉伴隨病毒3（Grapevine leafroll-associated virus-3，GLRaV-3）、葡萄斑點(diǎn)病毒（Grapevine fleck virus，GFkV）、葡萄扇葉病毒（Grapevine fanleaf virus，GFLV）、沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒（Grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV）、葡萄病毒A（Grapevine virus A，GVA）、葡萄病毒B（Grapevine virus B，GVB）和葡萄灰比諾病毒（Grapevine Pinot gris virus，GPGV）的特異性檢測引物[4-9]。多糖多酚RNA提取試劑盒產(chǎn)自北京華越洋生物科技有限公司；二步法RTPCR試劑盒產(chǎn)自日本TaKaRa公司。S1000型PCR儀產(chǎn)自美國Bio-Rad公司。

1.3 RT-PCR檢測

‘陽光玫瑰’葡萄葉片總RNA提取及各葡萄病毒RTPCR檢測方法參照婁兵海等[2,10]。

1.4 嫁接傳毒

用熱處理結(jié)合超微（0.3～0.5 mm）莖尖組織培養(yǎng)獲得并通過RT-PCR檢測無毒的多年生健康無皺葉‘陽光玫瑰’母樹繁育的一年生扦插苗，于2019年6月1日嫁接經(jīng)RT-PCR鑒定攜帶多種病毒或單一病毒的有癥狀‘陽光玫瑰’老熟枝段和經(jīng)莖尖培養(yǎng)不帶毒的有癥狀‘陽光玫瑰’老熟枝段，長1～2 cm，每株嫁接接種2個芽，4株為一個處理，留3株作空白對照。嫁接30 d后檢查芽的存活情況，不存活的進(jìn)行補(bǔ)接，冬季修剪后下年春天萌發(fā)時保留被接種植株一個新芽生長，在2020年5月15日和2021年4月20日觀察癥狀表現(xiàn)情況。

2 結(jié)果和分析

對田間表現(xiàn)葉片斑駁、皺縮畸形、小葉等癥狀的17株‘陽光玫瑰’進(jìn)行葡萄病毒RT-PCR檢測。結(jié)果表明，70.6%（12/17）的有癥‘陽光玫瑰’植株攜帶GLRaV-1、GLRaV-3、GFkV、GFLV、GRSPaV、GVA、GVB和GPGV中的一種或多種（表1），表明‘陽光玫瑰’葡萄葉片皺葉、花葉、畸形癥狀與葡萄病毒侵染密切相關(guān)。但也有29.4%（5/17）的有癥‘陽光玫瑰’植株未檢測出上述8種病毒。

所有試驗(yàn)的脫毒‘陽光玫瑰’葡萄植株一年生苗，在嫁接帶毒莖段前均生長良好，未觀察到葉片斑駁、皺縮畸形、小葉等癥狀。

兩次觀察結(jié)果顯示，被嫁接植株相繼表現(xiàn)葉片斑駁、皺縮畸形、小葉癥狀（圖2）。在兩次觀察中，被嫁接鑒定的17個單株4個重復(fù)中至少有一株表現(xiàn)帶毒癥狀的有16個單株，只有1個被鑒定單株沒有表現(xiàn)典型癥狀，該單株在嫁接前也未檢測出葡萄病毒。而作為空白對照的植株，仍生長良好，葉片正常，未出現(xiàn)上述癥狀。

圖2 脫毒無癥狀陽光玫瑰嫁接染毒后的癥狀表現(xiàn)Figure 2 Symptoms shown on healthy 'Shine Muscat' grapevines grafted with scions infected or uninfected by grapevine viruses

上述結(jié)果表明‘陽光玫瑰’葡萄上出現(xiàn)的皺葉、花葉、畸形癥狀是通過嫁接傳播的病原物引起，并非品種特性。結(jié)果也表明，‘陽光玫瑰’葡萄對病毒極為敏感，嫁接帶單一病毒的莖段即可引起癥狀表現(xiàn)，如2號、3號單株，但這兩個單株嫁接的4個重復(fù)中均只有2株表現(xiàn)出輕微的斑駁癥狀。結(jié)合癥狀觀察還發(fā)現(xiàn)，嫁接帶多種病毒的莖段癥狀表現(xiàn)更為明顯，如YG3-9-PZ，嫁接傳毒的4個重復(fù)兩年都發(fā)病，而且癥狀明顯，說明病毒復(fù)合侵染可加重‘陽光玫瑰’葉片癥狀表現(xiàn)。

此外，未檢測出葡萄病毒的5個有癥單株，嫁接后亦引起健康‘陽光玫瑰’表現(xiàn)輕微的斑駁、皺葉癥狀。

3 討論

本研究對‘陽光玫瑰’上出現(xiàn)的葉片皺葉、花葉、畸形癥狀是否通過嫁接傳播進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，‘陽光玫瑰’葉片皺葉、花葉、畸形癥狀可以通過嫁接進(jìn)行傳播，從而確定上述癥狀是由病原物侵染引起，而非該品種特性。結(jié)合RT-PCR檢測結(jié)果，推測是由于病毒侵染造成，這與婁兵海等[2]報道的結(jié)果一致。

嫁接試驗(yàn)中，部分單株的4個重復(fù)有部分表現(xiàn)出癥狀，但也有部分重復(fù)未表現(xiàn)出癥狀（表1），這種現(xiàn)象可能與當(dāng)年肥水、植株生長狀況有關(guān)，因?yàn)樘镩g多年觀察結(jié)果也發(fā)現(xiàn)有癥‘陽光玫瑰’葡萄植株其癥狀有些年份輕，有些年份重，或者不表現(xiàn)癥狀。嫁接試驗(yàn)結(jié)果也表明，嫁接材料攜帶的病毒種類越多，嫁接后‘陽光玫瑰’植株表現(xiàn)的癥狀就越重，這一結(jié)果也與婁兵海等[2]推測的病毒復(fù)合侵染會加重植株癥狀表現(xiàn)的結(jié)論一致。

表1 ‘陽光玫瑰’葡萄嫁接傳毒癥狀調(diào)查結(jié)果Table 1 Results of graft innoculation of grapevine viruses on 'Shine Muscat' grapevines

此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，未檢測出攜帶以上8種葡萄病毒的‘陽光玫瑰’植株葉片則表現(xiàn)出癥狀，其癥狀也可通過嫁接進(jìn)行傳播，推測可能是這些植株攜帶其他病毒，因?yàn)槠咸焉弦褕蟮降牟《疽堰_(dá)80種[1]。范旭東、李晨等[12-13]報道從部分有癥‘陽光玫瑰’植株中還檢測出蠶豆萎蔫病毒（Grapevine fabavirus，GFabV）、葡萄漿果內(nèi)壞死病毒（Grapevine berry inner necrosis virus，GINV）、葡萄卷葉伴隨病毒2（Grapevine leafrollassociated virus-2，GLRaV-2）、葡萄卷葉伴隨病毒4（Grapevine leafroll-associated virus-4，GLRaV-4）和葡萄病毒E（Grapevine virus E，GVE）。這也表明，‘陽光玫瑰’葡萄對病毒感染極其敏感。

檢測鑒定果樹病毒類病害的方法有很多，一些快速鑒定方法，如電鏡技術(shù)、血清學(xué)方法、核酸雜交、RTPCR檢測、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、基因芯片和高通量測序等，這些方法提高了植物病毒類病害的鑒定效率。但這些快速鑒定方法也會因?yàn)槲廴尽⑷硬课弧⑷訒r間、樣品帶毒少或不帶毒而誤檢、漏檢。而傳統(tǒng)的指示植物鑒定對檢測結(jié)果相對穩(wěn)定和可靠。

鑒于‘陽光玫瑰’葡萄對病毒極其敏感，在鑒定葡萄病毒病時，可用其作為病毒病鑒定指示植物，以提高葡萄病毒病鑒定準(zhǔn)確率，保證葡萄的脫毒母樹不帶病毒。該品種的發(fā)展必須使用脫毒無病種苗。