5-氮胞苷提高‘水晶’葡萄耐鋁性的相關機制研究

徐仕琴，陳姣，張永福，莫麗玲

（昆明學院農學與生命科學學院，云南昆明 650214）

地殼中鋁的平均含量高達8%，在中性或堿性土壤中，鋁以無毒鋁硅酸鹽的固定態存在，植物難以吸收，不會產生毒害。但由于酸雨導致土壤酸化加劇[1]，鋁溶出增加，活性鋁數量急劇上升，Al3+轉化為離子態析出對植物造成毒害[2]，成為限制作物發育和生產力的主要因素[3]。我國的紅壤富含鋁，約占總面積的20%[4]，因此研究如何降低鋁脅迫對作物的影響意義重大。5-氮胞苷是一種DNA甲基化抑制劑，通過去除甲基化胞嘧啶中的一種甲基，使基因組甲基化水平降低的堿基類似物[5]。DNA甲基化存在一個閾值范圍，在此范圍內促進植物的生長發育[6]，其中DNA甲基化水平降低是植物應對脅迫的方式之一[7]，能夠激活一些基因的表達，增強耐逆境能力[8-9]。5-氮胞苷在作物中的應用已被證明具有新的有益性狀，主要集中在生理[10-11]、表型[12]、表觀遺傳狀態的改變[9]，可提高紅麻的耐鹽性[13]，保護小麥免受鹽脅迫[14]。此外，5-氮胞苷還應用于擬南芥在高土壤鹽分、熱脅迫和干旱脅迫下的研究[15]，關于植物對逆境反應的研究相對較少，5-氮胞苷應用于鋁脅迫下生理機制的響應研究目前未見相關報道。

葡萄在酸性土壤中栽培，同其它作物一樣面臨著鋁毒害作用。主要體現在抑制植物體內重要生物學過程，例如破壞細胞膜導致細胞內滲透不平衡、抑制光合作用、活性氧防御系統失衡、膜脂過氧化水平上升等[16]。此外，根系和植株發育受到嚴重遏制，影響其對水分和養分的吸收[17]，氮磷鉀含量減少[18]。因此，在葡萄植株受到鋁脅迫時利用5-氮胞苷緩解葡萄在鋁毒脅迫下的傷害，為葡萄生產提供一定的理論依據，對葡萄產業發展具有積極作用。本研究以‘水晶’葡萄扦插苗為材料，在Hoagland's營養液中加入硫酸鋁后，噴灑不同濃度的5-氮胞苷，35 d后測定各處理植株生長狀況、以及營養物質對鋁脅迫的應激響應，探討緩解鋁毒害途徑，提供一定的抗鋁栽培理論依據，促進酸性土壤葡萄產區的發展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

挑選來自云南省彌勒市東風農場管理局的歐美雜種‘水晶’葡萄當年生健壯枝條，栽植于25 cm×30 cm營養缽中，每缽栽植1株，每3 d澆500 mL的Hoagland's營養液（pH＝4.8）。

1.2 試驗設計

在Hoagland's營養液中加入20 mmol·L-1Al2(SO4)3，與此同時噴灑不同濃度5-氮胞苷，濃度分別為0、100、200、400、800 μmol·L-1，每7 d噴灑1次，以不加硫酸鋁不噴灑5-氮胞苷為對照。各處理具體如下：T0：Hoagland's營養液＋20 mmol·L-1Al2(SO4)3；T1：Hoagland's營養液＋20 mmol·L-1Al2(SO4)3＋100 μmol·L-15-氮胞苷；T2：Hoagland's營養液＋20 mmol·L-1Al2(SO4)3＋200 μmol·L-15-氮胞苷；T3：Hoagland's營養液＋20 mmol·L-1Al2(SO4)3＋400 μmol·L-15-氮胞苷；T4：Hoagland's營養液＋20 mmol·L-1Al2(SO4)3＋800 μmol·L-15-氮胞苷；CK：Hoagland's營養液。處理時間為35 d。每隔7 d取成熟、健康、生長均勻一致的葉片，去離子水清洗干凈。用烘箱105 ℃殺青10 min后轉為95 ℃徹底烘干，研磨成粉末，過80目標準篩，收集篩下的粉末用于測定各項指標。試驗重復4次。

1.3 指標測定方法

株高和根長測量用卷尺；莖粗測量用游標卡尺；植株和根的鮮質量測量用電子天平；根系體積測量用排水法。

根冠比（%）＝（地下部分鮮質量÷地上部分鮮質量）×100。

逆境相關指標測定：丙二醛（MDA）采用雙組分光光度法[19]；葉綠素、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的測定參照張志良的方法[20]；氮、磷、鉀的測定分別采用納氏試劑顯色法、鉬藍法、四苯硼鈉法；可溶性糖、淀粉和蛋白質含量測定參照高俊鳳[21]；鋁含量的測定采用洛天青S顯色法。

1.4 數據處理

SPSS 19.0軟件進行數據統計分析，Duncan's 新復極差法檢驗差異顯著性（P＜0.05），用Excel作圖。

2 結果及分析

2.1 5-氮胞苷對鋁脅迫下葡萄形態指標的影響

為了觀察5-氮胞苷對鋁脅迫下葡萄植株發育的影響，記錄了處理35 d后植株和根系的狀態。從圖1可看出，與CK相比，T0、T3、T4植株莖葉萎蔫比對照明顯，T2植株葉片存在失水現象，其中T1植株未出現異常現象。從圖1還可看出，與CK相比，T0、T2、T3、T4根系顏色發黑，須根數目少甚至不長，主根伸長緩慢，T1一定程度抑制了鋁脅迫對根系的毒害，表現在根系生長茂盛且根生物量增加。

圖1 5-氮胞苷對鋁脅迫下葡萄植株和根系的影響Figure 1 Effects of 5-azacуtidine on grape plants and roots under aluminum stress

從表1可看出，與CK相比，T0株高降低6.34%，莖粗增加67.79%，T1的株高比T0的高，且差異達到顯著水平；與CK相比，T0的根鮮質量、根體積、根長分別下降12.86%、42.18%、37.31%，根冠比升高32.99%，T1、T2的根鮮質量、根體積高于T0，根冠比低于T0，且達到差異顯著性水平；此外T1的根長顯著高于T0。可見，在鋁脅迫下，不同濃度的5-氮胞苷對葡萄生長的影響較大，總體上100、200 μmol·L-1可不同程度的緩解鋁毒傷害，但100 μmol·L-1的效果最好，400、800 μmol·L-1反而加重鋁毒傷害，阻礙植株生長發育，可能是植株受到鋁脅迫和5-氮胞苷的雙重傷害。

表1 5-氮胞苷對鋁脅迫下葡萄形態指標的影響Table 1 Effects of 5-azacуtidine on morphological indexes of grape under aluminum stress

2.2 5-氮胞苷對鋁脅迫下葡萄生理指標的影響

從表2可看出，鋁脅迫下的葡萄葉片MDA含量比對照明顯提高。5-氮胞苷處理后，MDA含量大幅度下降，T1、T2、T3的MDA含量顯著低于T0，分別下降了54.13%、31.67%、15.34%。從表2還可看出，T0葉綠素和類胡蘿卜素與CK相比顯著下降，但一定濃度的5-氮胞苷可減緩這種現象，其中T1與T0葉綠素a＋b、類胡蘿卜素之間的差異顯著，分別上升11.35%、34.31%。由此可見，鋁脅迫下，100 μmol·L-1的5-氮胞苷可降低MDA含量，提高葉綠素含量，對增強植株的耐鋁性具有重要作用，從而減緩鋁脅迫對植株的毒害。

表2 5-氮胞苷對鋁脅迫下葡萄葉片生理指標的影響Table 2 Effects of 5-azacуtidine on phуsiological indexes of grape leaves under aluminum stress

2.3 5-氮胞苷對葡萄脯氨酸、可溶性蛋白質的影響

從圖2可看出，鋁脅迫下脯氨酸含量迅速合成并積累。在整個試驗期，鋁脅迫下的脯氨酸含量均顯著高于CK，而T1、T2顯著低于T0。從圖2還可以看出，在整個試驗期，所有處理的蛋白質含量均顯著低于CK；14、21 d時，T0的蛋白質含量顯著低于其他處理；35 d時，T1、T2的蛋白質含量顯著高于T0，而T3、T4顯著低于T0。可見，鋁脅迫下，噴灑100、200 μmol·L-1的5-氮胞苷后，可減少脯氨酸的積累和加快蛋白質的合成，從而減緩鋁脅迫對植株的毒害，增強植株的耐鋁性。

圖2 5-氮胞苷對鋁脅迫下葡萄葉片脯氨酸和蛋白質的影響Figure 2 Effects of 5-azacуtidine on proline and protein in grape leaves under aluminum stress

2.4 5-氮胞苷對葡萄葉片SOD和POD活性的影響

SOD和POD二者聯合作用保護植物，能夠避免自由基積累對生物膜造成破壞。從圖3可看出，從試驗開始的7～35 d，4個處理的SOD和POD活性都低于CK；21、28、35 d時T1、T2、T3、T4的SOD活性顯著高于T0，其中T1又顯著高于T3、T4。從圖3還可看出；14 d時，T2的POD活性顯著低于其它處理；21、28、35 d時，T1顯著高于T0，T3、T4顯著低于T0。可見在鋁脅迫下，植株SOD、POD活性減弱，噴灑100 μmol·L-1的5-氮胞苷可緩解這種現象，此濃度的5-氮胞苷對提高葡萄耐鋁性發揮了一定的作用。

圖3 5-氮胞苷對鋁脅迫下葡萄葉片SOD和POD活性的影響Figure 3 Effects of 5-azacуtidine on SOD and POD activities in grape leaves under aluminum stress

2.5 5-氮胞苷對葡萄葉片氮、磷、鉀的影響

從圖4可看出，7、14 d時，T0的氮含量最高，其次是T1，而T4則最低；21、28、35 d時，T1、T2均顯著高于T0，其中T1在21、28 d時高于CK；7 d時，T0的磷含量顯著低于CK、T1、T4；14～35 d時，T0均顯著低于CK、T1、T2；T1除14 d外其它時期均顯著高于T2、T3、T4；7 d時，T0的鉀含量顯著低于CK、T3、T4；14、21 d時，T0顯著低于其它處理；28、35 d時，T0顯著低于CK、T1、T2，T4顯著低于T0。可見，鋁脅迫下葡萄葉片的氮、磷、鉀積累量均不同幅度的被抑制，但使用100 μmol·L-1的5-氮胞苷可明顯減緩這些營養物質被抑制的程度，從而提高植株耐鋁性。

圖4 5-氮胞苷對鋁脅迫下葡萄葉片氮、磷、鉀的影響Figure 4 Effects of 5-azacуtidine on nitrogen, phosphorus and potassium in grape leaves under aluminum stress

2.6 5-氮胞苷對葡萄可溶性糖、淀粉的影響

從圖5可看出，7～35 d，CK的可溶性糖和淀粉含量均高于其它處理。7 d時，T0的可溶性糖含量顯著低于其它處理；21 d時，T1、T2顯著高于T0；28 d時，T1顯著高于T0；35 d時，T1、T2顯著高于T0，T3、T4顯著低于T0。從圖5還可看出，7 d和14 d時，T0的淀粉含量顯著低于其它處理；21 d時，T1、T2顯著高于T0；28 d和35 d時，T1顯著高于T0，T2、T3、T4顯著低于T0。可見，鋁脅迫下使用100 μmol·L-1的5-氮胞苷可明顯提高可溶性糖和淀粉含量在葡萄葉片中的積累。

圖5 5-氮胞苷對鋁脅迫下葡萄葉片可溶性糖和淀粉的影響Figure 5 Effects of 5-azacуtidine on soluble sugar and starch content in grape leaves under aluminum stress

2.7 5-氮胞苷對鋁脅迫下葡萄葉片鋁含量的影響

從圖6可看出，整個試驗期間，CK的鋁含量均低于其它處理。7 d時，T0的鋁含量顯著高于其它處理；14 d時，T1顯著低于T0；21、28、35 d時，T1、T2、T3顯著低于T0，此外T1顯著低于T2、T3、T4。由此可見，本研究中鋁脅迫下的鋁含量大量積累，但噴灑5-氮胞苷可降低鋁含量的積累，其中100 μmol·L-1的5-氮胞苷效果最顯著，顯著增強了植株的耐鋁性，對提高鋁脅迫下植株的適應性發揮了重要作用。

圖6 5-氮胞苷對鋁脅迫下葡萄葉片鋁含量的影響Figure 6 Effect of 5-azacуtidine on aluminum content in grape leaves under aluminum stress

3 討論與結論

逆境脅迫會引起植物體內DNA甲基化水平的改變，導致植物生長發育的不正常和形態異常[22]，植物在遭受鋁毒害時根系出現的癥狀最明顯，表現“短而粗硬且不分枝”，植株形態嚴重萎縮，大大減弱植株抗逆性[3]。5-氮胞苷可降低植株體內的DNA甲基化水平，提高植株的抗逆性，緩解逆境脅迫下的傷害[23]。植物生長受抑制的直觀體現是生物產量，本研究表明，鋁脅迫使葡萄株高、根鮮質量、根長和根體積減少，莖粗增大，根冠比降低，與黃守程[24]、張永福[25]研究結果一致，此時地上部和地下部生物量都減小，鋁全面入侵植株。本研究中100、200 μmol·L-1的5-氮胞苷噴灑后可增加葡萄株高、降低莖粗，促進根系統發育。

本研究中，鋁脅迫下，葉綠體被膜受到破壞，抑制光合作用，膜脂過氧化加重，從而導致葉綠素下降和丙二醛大量積累；100 μmol·L-1的5-氮胞苷噴灑后，可增強葉綠素和減弱丙二醛的積累。脯氨酸可以減少細胞質膜受到外界影響，蛋白質是生理功能的執行者[26]，本研究中，鋁脅迫下滲透調節失衡導致生理功能執行力下降，脯氨酸含量上升，蛋白質含量下降；噴灑100、200 μmol·L-1的5-氮胞苷后，可緩解這種現象，與黃菲[27]的研究結果相似，即5-氮胞苷提高鹽脅迫下水稻蛋白質含量。SOD和POD作為植物體內清除活性氧的關鍵酶，SOD將O2-歧化成H2O2和O2，POD將H2O2分解為H2O和O2[28]。本研究中，在鋁脅迫下植株細胞膜傷害加重，細胞代謝產物活性氧大量積累，SOD和POD的活性均受到強烈抑制，噴灑100 μmol·L-1的5-氮胞苷可增強其活性，與李鵬程[29]研究結果相似，即干旱脅迫下5-氮胞苷可提高馬鈴薯SOD和POD活性。本研究還發現，鋁脅迫下根系中的鋁向上運輸的能力增強，削弱了礦質元素氮、磷、鉀從根系向上運輸的能力，從而減弱氮、磷、鉀的吸收能力，降低其轉運能力和在葉內的積累；噴灑100 μmol·L-1的5-氮胞苷后，緩解鋁在葉片中的積累從而增強營養物質的運轉，與潘雅姣等[30]研究結果相似，即5-氮胞苷提升了水稻中氮、磷、鉀含量，提高了水稻耐旱性。

植物在逆境脅迫下的生長狀況可以評價該種植物的抗逆性。5-氮胞苷在達到一定濃度時，也具有一定的正向效應。低濃度的5-氮胞苷可以起到促進作用，而高濃度反而起抑制作用[27]，本研究中較高濃度（400、800 μmol·L-1）5-氮胞苷對葡萄生長產生了雙重毒害作用，減弱葡萄耐鋁性，不但抑制葡萄植株根系發展，無法進行正常的光合作用，而且營養物質得不到吸收，最終導致植株形態萎縮嚴重，甚至干枯死亡。這可能是由于5-氮胞苷濃度太高，使DNA甲基化水平大幅度降低，基因表達增強，從而消耗了體內的營養物質，產生該現象的原因還有待進一步研究。

本研究中，100 μmol·L-1的5-氮胞苷緩解鋁脅迫的毒害效果顯著，5-氮胞苷可能通過絡合鋁減輕鋁毒害，抑制鋁向地上部運轉和提高光合色素協同作用，抑制活性氧和激活氧化防御系統，降低滲透調節物質積累，促進礦質元素的吸收、有利于蛋白質、可溶性糖、淀粉的合成，從而使細胞膜免遭破壞，增強葡萄對鋁脅迫的適應能力。由此可見，100 μmol·L-1的5-氮胞苷在提高葡萄苗的耐鋁性中發揮了重要作用。