不同產區陳釀干紅葡萄酒花色苷與顏色相關性分析

吳璐璐，范舒悅，張煜，李運奎,2*

（1. 西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100；2. 西北農林科技大學寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗示范站，寧夏閩寧 750104）

顏色是葡萄酒感官質量和內在質量的重要組成部分，能夠最直觀地反映出葡萄酒的類型、品質、貯存性甚至營養價值等信息，顏色純正、亮麗、穩定的葡萄酒會更加受到消費者青睞[1-2]。在葡萄酒釀造工藝優化、過程質量控制、感官品評分析、產區和品種特色認定等方面，顏色都發揮著不可忽視的作用。目前，關于葡萄酒顏色主要集中在影響因素研究[3-7]、顏色特征表征與評價研究[8-11]、顏色基礎物質分析研究[12]和顏色演化規律研究[13-14]等方面。尤其是顏色影響因素的研究受到了較多關注，如葡萄品種、栽培與管理措施、原料成熟度狀況、釀造工藝、陳釀條件、花色苷與無色多酚等關鍵成分、pH等。

花色苷（anthocyanin）是紅葡萄酒顏色的物質基礎，Han等人[15]采用主成分回歸分析法研究了新釀‘赤霞珠’葡萄酒中花色苷與顏色的關系，發現參與分析的花色苷可以解釋葡萄酒紅色的64.56%～81.57%，其他研究者也得到了類似的結論[16]。一般來說，以上因素對紅葡萄酒呈色的影響都需通過影響花色苷的組成、含量或存在形式等才能實現[17-18]。在歐亞種年輕紅葡萄酒中，花色苷主要以單體形式存在，包括5種基本花色苷（非酰化花色苷）：花翠素-3-O-葡萄糖苷（delphinidin-3-O-glucoside,Dnd-G）、花青素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside,Cnd-G）、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷（petunidin-3-O-glucoside, Ptnd-G）、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucoside, Pnd-G）和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（malvidin-3-O-glucoside, Mvd-G），及其與乙酸、香豆酸、咖啡酸和阿魏酸等形成的酰化花色苷[12-13]。通常年輕紅葡萄酒中基本花色苷含量略高于酰化花色苷，聚合花色苷含量很低[13]，Cnd-G和Pnd-G主要貢獻橘黃色色調，Dnd-G、Ptnd-G和Mvd-G主要貢獻紫紅色色調，酰化花色苷對顏色的貢獻可能大于非酰化花色苷[12]。隨著陳釀的進行，單體花色苷傾向于與乙醛、丙酮、咖啡酸等酸類、4-乙烯基兒茶酚等酚類、以及黃烷醇類物質反應，生成結構更復雜、活性更低、更穩定的聚合花色苷（如吡喃花色苷）[14]。聚合花色苷的生成使酒體顏色更穩定，但黃色色調卻占據更大比例，因為吡喃花色苷主要貢獻橙紅或橘黃色調，其他聚合花色苷貢獻橙黃、紫紅或藍色色調[12]。可見，深入研究紅葡萄酒的顏色特征及其與花色苷種類和含量的關系，對生產具有更高顏色品質的紅葡萄酒意義重大。

目前對國內紅葡萄酒顏色特征及花色苷影響的研究報道較少。相關報道往往只涉及少數產區[19]，并以研究年輕紅葡萄酒為主[8,13,20]。本研究選取國內10個產區（子產區）的陳釀‘赤霞珠’干紅葡萄酒，及山東產區的陳釀‘赤霞珠’‘蛇龍珠’‘品麗珠’和‘美樂’干紅葡萄酒，采用紅葡萄酒顏色特征的直觀表征法[21]和相關統計分析方法，分析我國多產區、多品種的陳釀紅葡萄酒顏色特征及與花色苷的相關關系，以期為相關研究和生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以云南、新疆、甘肅、寧夏、河北、陜西和山東產區共10款‘赤霞珠’干紅葡萄酒。具體產地：1#-云南迪慶；2#-新疆和碩；3#-甘肅嘉峪關；4#-寧夏玉泉營；5#-河北昌黎；6#-河北沙城；7#-陜西咸陽；8#-山東煙臺；9#-甘肅武威；10#-新疆五家渠；11#～13#為山東產區‘蛇龍珠’‘品麗珠’和‘美樂’干紅葡萄酒。所有酒樣均為2015年份壓榨，不銹鋼罐儲存。

酒石酸鉀鈉、硫酸銅、葡萄糖、氫氧化鈉、碘、碘化鉀、氯化鉀、鹽酸、三水醋酸鈉、醋酸、硫酸、淀粉、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞與亞甲基藍等藥品均為分析純，由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。乙腈、甲醇、甲酸購自廣州市金華大化學試劑有限公司，均為色譜純。標準樣品Mvd-G購自Sigma公司。實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

日本島津公司UV-1750紫外可見分光光度計、LC-10Avp高效液相色譜儀；芯硅谷一次性無菌針式過濾器及0.45 μm微孔濾膜由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

1.3 方法

去離子水做參比，將葡萄酒樣品經0.45 μm濾膜過濾后，采用2 mm光程玻璃比色皿，用UV-1750紫外可見分光光度計掃描酒樣在可見光區400～780 nm內的吸收光譜，間隔1 nm，每酒樣重復3次。CIELAB參數計算選用10°觀察者視場，D65標準白光源[8,22]，將吸收光譜中450、520、570、630 nm波長處的吸光度值校正到1 cm光程后，參考文獻21中的方法計算參數L*、a*、b*、和hab。采用紅葡萄酒顏色特征的直觀表征法表征供試酒樣顏色特征[21]。首先，在CIELAB顏色空間中，取L*＝60，構建二維高清彩度平面（a*＝0～60,b*＝0～60），將供試酒樣的a*和b*參數投影到該平面上，得到酒樣顏色的彩度分布圖。其次，根據L*值，在一維的明度圖上標記出各供試酒樣，得到酒樣顏色明度分布情況。最后，綜合考慮L*、a*和b*三個參數對顏色的貢獻，在明度圖上將各酒樣渲染上相應的顏色，即得到酒樣的特征顏色圖，表征在自然觀察條件下酒體所呈現的顏色。

采用pH示差法（化學法）測定總花色苷含量，方法詳見文獻8。采用高效液相色譜（HPLC）法測定總花色苷和單體花色苷組成與含量[23]。以Mvd-G標準樣品繪制標準曲線：y＝61370x－20641，其中y為峰面積，x為標準溶液質量濃度，R2＝0.9999。根據文獻得出Dnd-G、Cnd-G、Ptnd-G、Pnd-G和Mvd-G5種基本花色苷；甲基花青素-3-O-乙酰葡萄糖苷（peonidin-3-O-(6-O-acetyl)-glucoside，Pnd-AG）、二甲花翠素-3-O-乙酰葡萄糖苷（malvidin-3-O-(6-O-acetyl)-glucoside，Mvd-AG）、甲基花青素-3-O-咖啡酰葡萄糖苷（peonidin-3-O-(6-O-caffeoуl)-glucoside，Pnd-CG）和二甲花翠素-3-O-咖啡酰葡萄糖苷（malvidin-3-O-(6-O-caffeoyl)-glucoside，Mvd-CG）4種酰化花色苷的出峰順序，定性確定該9種單體花色苷，并進一步根據標準曲線方程對各花色苷含量進行定量分析。相關色譜條件及詳細方法參考文獻23。

1.4 數據處理

使用OriginPro 8、IBM SPSS Statistics 22以及Fireworks 8完成吸收光譜繪制、數據統計分析、高清CIELAB色空間彩度和明度分布圖以及葡萄酒特征顏色圖繪制。

2 結果與分析

2.1 顏色特征分析

基于CIELAB色空間與可見吸收光譜，前期提出了采用彩度分布圖、明度分布圖和特征顏色圖對紅葡萄酒顏色特征進行直觀表征[21]。將各酒樣的a*和b*參數投影到L*＝60平面上即得彩度分布圖（圖1左），各投影點（酒樣編號放置處）的顏色即代表該酒樣只考慮a*和b*參數，且L*＝60時的顏色特征。彩度分布圖清晰地呈現了各酒樣a*和b*參數的相對大小，以及等參數的信息及彼此關系。各顏色投影點到原點的距離即為相應酒樣的色度其所在直線與a*軸夾角即為色調hab，兩顏色投影點間的距離代表該兩種酒樣顏色的總色差距離越大，總色差越大。在一維明度坐標軸上，依據L*大小排列酒樣位置（以帶編號的圓斑表示酒樣），得到酒樣顏色的明度分布圖（圖1右）。進一步綜合考慮L*、a*和b*三參數對顏色的貢獻，使各圓斑渲染上相應的顏色，即得各酒樣的特征顏色圖（圖1右）。特征顏色表征酒樣在自然觀察條件下（自然白光、10°觀察視角）酒體所呈現的宏觀顏色；彩度分布和明度分布圖則從正交的L*、a*和b*三因素剖析了宏觀顏色的成因，尤其是顏色差異的來源。

圖1 供試酒樣CIELAB彩度分布圖（左）、明度分布與特征顏色圖（右）Figure 1 Colorfulness distribution (left), lightness distribution and feature color (right) of thirteen wine samples

由圖1可見，供試酒樣紅色分量a*較大，最大與最小者分別為4#和10#酒樣，但彼此間分布較集中，差異較小。黃色分量b*分布分散，酒樣間差異較大，4#酒樣的b*最大；10#酒樣的b*最小。較大的b*差異導致了較大的色度和色調差異。4#酒樣色度最高，色調角最大，呈橙紅色，黃色色調貢獻明顯；10#酒樣色度最低，色調角最小，呈明顯的紫紅色，黃色色調貢獻弱。在不考慮明度差異的情況下，4#與10#酒樣由于距離最遠，總色差最大。1#～10#不同產區的酒樣間特征顏色差異明顯，a*差異較小，b*、差異都較大，說明產地因素及相關釀造工藝的差異導致了酒樣間顏色的顯著差異，且黃色色調對顏色的貢獻很大。8#和11#～13#同產區不同品種酒樣間特征顏色存在差異，a*差異較小，b*、差異都較大，說明品種因素及相關釀造工藝的差異導致了酒樣間顏色的顯著差異，且黃色色調對顏色的貢獻很大。對比來看，產地因素對葡萄酒顏色差異的貢獻可能大于品種因素。這也可以通過供試酒樣可見吸收光譜加以印證，如圖2。各吸收光譜曲線的總體趨勢一致，升降幅度接近，且8#和11#～13#酒樣分布較1#～10#酒樣更集中。

圖2 酒樣在可見光區的吸收光譜圖Figure 2 Visible absorption spectra of thirteen wine samples

2.2 花色苷組成與含量

如圖3所示，化學法和HPLC法測定供試酒樣總花色苷含量分別為17.9～154.2、22.7～114.0 mg·L-1。對各酒樣來說，雖然兩種方法測定的絕對含量存在差別，但酒樣間相對含量大小趨勢一致，4#酒樣含量最低，10#酒樣含量最高。

圖3給出了HPLC法測定的總花色苷組成情況，包括Dnd-G、Cnd-G、Ptnd-G、Pnd-G、Mvd-G、Pnd-AG、Mvd-AG、Pnd-CG和Mvd-CG 9種單體花色苷總含量及其他酰化花色苷和聚合花色苷。9種單體花色苷含量在6.1～75.1 mg·L-1，4#酒樣含量最低，10#酒樣含量最高；9種單體花色苷占總花色苷含量的16.75%～65.88%，4#、8#和12#占比都較低，10#最高。另外，其他酰化花色苷和聚合花色苷含量在16.6～42.2 mg·L-1，占總花色苷的34.12%～83.25%，部分酒樣甚至高于9種單體花色苷的含量。

圖3 化學法（左）與HPLC法（右）測定的總花色苷含量Figure 3 Total anthocyanins content of thirteen wine samples by chemical analysis (left) and HPLC analysis (right)

9種單體花色苷的組成與含量見表1，各酒樣分布輪廓基本一致，Mvd-G是含量最高的花色苷，占9種單體花色苷含量的40.66%～61.89%，占總花色苷含量（HPLC法）的6.77%～31.23%；Mvd-AG一般是含量最高的酰化花色苷，占9種單體花色苷含量的8.02%～23.77%。Dnd-G、Cnd-G、Ptnd-G、Pnd-G和Mvd-G 5種基本花色苷含量在4.33～51.67 mg·L-1，占9種單體花色苷含量的61.42%～84.32%，占總花色苷含量的10.21%～51.12%；其余4種酰化花色苷含量在1.70～23.39 mg·L-1，占9種單體花色苷含量的15.68%～38.58%，占總花色苷含量的6.42%～20.52%。

表1 供試酒樣單體花色苷組成與含量Table 1 The content and composition of monomeric anthocyanins of thirteen wine samples mg·L-1

2.3 紅葡萄酒花色苷與顏色特征的相關性

花色苷是紅葡萄酒呈色的物質基礎，為了探究供試酒樣顏色特征與花色苷含量的關系，將表征顏色特征的參數和hab，表征可見吸收光譜特征的參數A520（酒樣在520 nm處吸光度值，1 cm光程，下同）和ΔA（酒樣在520 nm與450 nm處吸光度值之差）[21]，與化學法和HPLC法測定的總花色苷含量、9種單體花色苷含量，及其他酰化和聚合花色苷含量進行Pearson相關分析，結果見表2。化學法測定的總花色苷含量與b*和hab在P≤0.05水平顯著相關，與其他顏色參數未表現出顯著相關性；HPLC法測定的總花色苷與5個顏色參數在P≤0.05水平都表現出相關性，且與b*和hab在P≤0.01水平呈極顯著相關。總花色苷與可見吸收光譜的特征參數A520和ΔA也存在顯著或極顯著相關性。可見，總花色苷含量對供試酒樣顏色影響重大，尤其對黃色色調b*和色調角hab影響更為明顯。

表2 CIELAB參數、吸收光譜和花色苷含量的相關性分析①Table. 2 Pearson correlation analysis between CIELAB parameters, absorption spectra and anthocyanins of thirteen wine samples

將HPLC法測定的總花色苷拆分為兩項：9種單體花色苷和其他花色苷（包括其他酰化和聚合花色苷），并分析其與顏色參數和可見吸收光譜參數間相關性。如表3所示，9種單體花色苷與hab顯著相關，與ΔA極顯著相關；其他花色苷則與5個顏色參數以及A520呈現顯著或極顯著相關。這說明9種單體花色苷對供試酒樣呈色依然有影響，但較年輕紅葡萄酒中弱[13,24-25]；其他酰化花色苷和聚合花色苷則是供試酒樣顏色的決定因素。

表3 CIELAB參數、吸收光譜和各單體花色苷含量的相關性分析Table 3 Pearson correlation analysis between CIELAB parameters, absorption spectra and monomeric anthocyanins

9種單體花色苷與顏色參數和可見吸收光譜參數間的Pearson相關分析表明，Dnd-G與所有顏色參數和可見吸收光譜參數無顯著相關性；Cnd-G和Ptnd-G都只與ΔA顯著相關；Pnd-G與L*、b*、顯著相關，與hab和ΔA極顯著相關；Mvd-G只與hab顯著相關，與ΔA極顯著相關；Pnd-AG與a*、b*、和hab顯著相關，與ΔA極顯著相關；Mvd-AG與b*、hab和ΔA顯著相關；Pnd-CG與b*、hab、A520和ΔA顯著相關；Mvd-CG與L*、b*、和ΔA顯著相關，與hab和A520極顯著相關。

3 討論與結論

花色苷是干紅葡萄酒中的重要多酚成分，與葡萄酒的呈色和口感等感官性質密切相關。在年輕干紅葡萄酒中，花色苷主要以簡單花色苷和酰化花色苷等單體形態存在，并對年輕干紅葡萄酒的呈色產生重要貢獻[25]。這些形態的花色苷化學性質活潑，易發生降解或聚合等轉化，致使在陳釀過程中一方面花色苷含量明顯降低，另一方面花色苷主要以聚合等形態存在，穩定性較高，對呈色產生持續貢獻[12]。

對我國10個產區、4個品種共13款陳釀干紅葡萄酒的花色苷組成分析表明，總花色苷含量為22.7～114.0 mg·L-1。總花色苷含量受產區和品種因素影響顯著，新疆的兩款酒樣總花色苷含量最高，寧夏的一款酒樣總花色苷含量最低。當然，這是葡萄原料質量與釀造工藝等環節和因素的綜合作用結果，并不能簡單反應某一方面因素的優劣。從花色苷組成來看，9種單體花色苷含量一般低于聚合花色苷含量，5種基本花色苷含量高于4種酰化花色苷含量，單體花色苷中Mvd-G的占比最大。不同產區和不同品種酒樣間的趨勢較一致。張世杰[23]等對來自我國不同產區、不同年份和不同品種的45款干紅葡萄酒樣品的花色苷組成與含量進行了分析，李偉[14]等分析了賀蘭山東麓賀蘭晴雪酒莊10個年份的‘赤霞珠’干紅葡萄酒花色苷組成與含量，均得出了與本研究類似的結果。

本研究基于CIELAB色空間，采用紅葡萄酒顏色可視化表征法[21]，直觀呈現了供試酒樣的宏觀顏色，并從L*、a*和b*三因素剖析顏色成因和差異的來源。結果顯示，產地和品種都會對葡萄酒宏觀呈色造成顯著影響。從明暗程度來說，酒樣間差異顯著，其中寧夏玉泉營的酒樣明度最高，新疆五家渠的酒樣明度最低；從紅色色調來說，供試酒樣間差異較小；從黃色色調來說，酒樣間差異顯著，其中寧夏玉泉營的酒樣黃色色調最重，新疆五家渠的酒樣黃色色調最淺，山東產區的‘蛇龍珠’‘品麗珠’和‘美樂’三個品種間黃色色調差異很大。結合花色苷含量來看，紅葡萄酒呈色品質與花色苷含量呈現出較好相關性，即花色苷含量越高，呈色質量越好（紅色色調重，黃色色調淺）。這種相關性在其他研究中也得到了印證，如有報道發現游離花色苷含量在陳釀過程中迅速下降，其下降趨勢與葡萄酒顏色“黃移”規律一致[14]。郭耀東[10]等發現總花色苷含量對紅葡萄酒明亮度、紅綠色調、黃藍色調均有顯著影響。Han等[19]發現呈現黃色色調的吡喃花色苷對4年酒齡的陳釀‘蛇龍珠’干紅葡萄酒顏色貢獻突出。從不同花色苷組成對酒樣顏色的貢獻來看，盡管Mvd-G和Mvd-AG是供試酒樣中含量最高的基本花色苷和酰化花色苷，但對供試酒樣顏色影響最大的基本花色苷是Pnd-G，影響最大的酰化花色苷是Mvd-CG和Pnd-AG。對比來看，4種酰化花色苷對供試酒樣顏色影響較大，5種基本花色苷則只有Pnd-G影響較大，所以酰化花色苷對陳釀紅葡萄酒顏色的貢獻大于基本花色苷的貢獻，這似乎與年輕紅葡萄酒的情形相似[12,15]。郭耀東等[10]也發現，Pnd-G對明度和紅色色調影響顯著，Cnd-G則對紅色色調影響顯著。

綜上，本研究主要結論為：（1）5年酒齡的陳釀型干紅葡萄酒花色苷組成和含量與酒體呈色緊密相關。（2）酰化花色苷含量低于基本花色苷，但對顏色的貢獻大于基本花色苷；二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-乙酰葡萄糖苷是含量最高的單體花色苷，但甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-咖啡酰葡萄糖苷和甲基花青素-3-O-乙酰葡萄糖苷是對酒體顏色影響最大的單體花色苷。（3）產區、品種等因素首先影響花色苷的組成與含量，進而影響酒樣宏觀呈色，且對黃色色調的影響大于對紅色色調的影響。