染色沉香中10種非法染色劑檢查方法的建立*

周 謐，龔旭東，徐丹洋，王素素，吳慧峰

（1.江蘇省南通市食品藥品監督檢驗中心，江蘇 南通 226006；2.南通三越中藥飲片有限公司，江蘇 南通 226300）

沉香為瑞香科植物白木香Aquilar ia s inensis（Lour.）Gilg含有樹脂的木材，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘功效，為治療氣逆喘息、嘔吐、呃逆、心腹疼痛的要藥［1］。白木香是我國生產中藥沉香的唯一植物資源，為我國特有的珍貴藥用植物，由于自然災害和人為破壞，野生資源在不斷減少，被列入國家二級保護野生植物。沉香不僅是中醫臨床常用名貴藥材，還是保健品、高級香料、化妝品等的原料，由于需求量大，資源緊張，導致市場中沉香藥材價格迅速上漲，質量混亂，以假亂真的現象較嚴重。沉香表面應為黑褐色樹脂與黃白色的木部相間，以往存在用松香浸泡不含或含較少樹脂的白木香使其醇溶性浸出物達標的情況，隨著標準的不斷完善，該類現象明顯減少［2］。但近來在日常抽檢過程中發現，部分沉香藥材樣品表面與合格品比較顏色偏黃，懷疑存在將劣質飲片通過工業染色劑染色后冒充或摻入優質飲片的情況［3-7］。為此，本研究中采用薄層色譜（TLC）法、超高效液相色譜-二極管陣列檢測器（UPLCDAD）法依次檢查，開展了沉香藥材中10種非法染色劑檢查方法的研究，并采用高效液相色譜串聯質譜（HPLCMS/MS）法對檢出成分進行確認［5，8-9］。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Thermo LCQ Fleet型質譜儀（美國Thermo Fisher公司，離子阱質譜儀）；CPA225D型電子分析天平（賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司，精度為十萬分之一）；KQ-500DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

橙黃G對照品（阿拉丁試劑＜上海＞有限公司，批號為C1608071）；橙黃I對照品（批號為RH100041），甲基橙對照品（批號為C00001424），皂黃對照品（批號為C00001408），均購自羅恩科技＜北京＞有限公司；甲基黃對照品（批號為J6180005），堿性橙21對照品（批號為2168K050），亮黃對照品（批號為B0410005），均購自上海安譜科學儀器有限公司；金胺O對照品（批號為111770-201603），檸檬黃對照品（批號為510004-201401，含量91.0%），日落黃對照品（批號為510005-201602，含量86.9%），沉香對照藥材（批號為121222-201203），均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（德國Merck公司）；沉香樣品共46批，為日常抽檢或市場購買；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。色素信息見表1。

表1 色素信息Tab.1 The information of illegal dyes

2 方法與結果

2.1 TLC法鑒別

鑒別：取藥材樣品粉末2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%乙醇20 mL，超聲（功率500 W，頻率40 kHz，下同）處理20 min，取出，放冷，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。量取10種色素對照品各適量，加70%乙醇制成每1 mL各約含0.1 mg的混合對照品溶液Ⅰ。取對照藥材，加70%乙醇20 mL，超聲處理20 min，取出，放冷，濾過，取續濾液，即得陰性對照品溶液。精密吸取上述3種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（6∶2∶4∶0.5，V/V/V/V）為一次展開劑，正丁醇-丙酮-乙酸乙酯-水-氨水（6∶6∶2∶2∶0.5，V/V/V/V/V）為二次展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視（溫度12℃，相對濕度45%）［10-11］。46批供試品溶液色譜中，有5批疑似檢出檸檬黃和日落黃，陰性對照無干擾。詳見圖1。檢測限考察：量取10種色素對照品各適量，加70%乙醇制成每1 mL中各約含0.01 mg的混合對照品溶液Ⅱ。同法試驗，以清晰可辨斑點的質量濃度作為檢測限。結果橙黃G、橙黃I、甲基橙、甲基黃、堿性橙21、金胺O、亮黃、檸檬黃、日落黃、皂黃的檢測限分別為0.013，0.016，0.010，0.011，0.010，0.010，0.010，0.010，0.009，0.011 mg/g。

圖1 薄層色譜圖1.Mixed reference solution I 2.Negative reference solution 3-11.Test solution（sunset yellow and lemon yellow are suspected in Test solution 7-11）Fig.1 TLC chromatograms

2.2 UPLC-DAD法驗證

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC?BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相：甲醇（A）-0.2 mol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～2 min時10%A→17%A，2～3 min時17%A→20%A，3～6 min時20%A→40%A，6～16 min時40%A→45%A，16～20 min時45%A→46%A，20～22 min時46%A→70%A，22～23 min時70%A→100%A）；流速：0.2 mL/min；檢測波長：420 nm；柱溫：35℃。

2.2.2 溶液制備

量取10種色素對照品各適量，加70%乙醇制成每1 mL中各約含0.04 mg的混合對照品溶液Ⅲ。

2.2.3 方法學考察

系統適用性與專屬性試驗：取混合對照品溶液Ⅲ、2.1項下疑似含染色劑的供試品溶液、2.1項下陰性對照品溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果理論板數按檸檬黃峰計不低于3 000［12-14］，陰性對照在與10種色素對照品相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。掃描230～630 nm波長范圍的紫外-可見吸收光譜，并進行峰純度檢查，結果峰純度均符合要求。詳見圖2（因篇幅所限，僅以對照品為例）。

圖2 超高效液相色譜-二極管陣列檢測器圖譜a.HPLC-DAD chromatograms b.UV spectrograms A.Orange I B.Lemon yellow C.Methyl orange D.Sunset yellow E.Methyl yellow F.Brilliant yellow G.Auramine O H.Orange G I.Basic orange 21 J.Metanil yellowFig.2 UPLC-DAD chromatograms

檢測限考察：取混合對照品溶液Ⅱ，倍比稀釋，并按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比為3∶1時的質量濃度為檢測限。結果橙黃G、橙黃I、甲基橙、甲基黃、堿性橙21、金胺O、亮黃、檸檬黃、日落黃、皂黃的檢測限分別為0.39，0.32，0.31，0.22，0.31，0.50，0.29，0.39，0.35，0.34μg/g。

2.2.4 樣品檢測

取混合對照品溶液Ⅲ，46批樣品的供試品溶液及2.1項下陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果在46批樣品中，有5批疑似檢出檸檬黃和日落黃，且與相應對照品的紫外-可見分光光譜圖完全一致。

2.3 HPLC-MS/MS確認

2.3.1 試驗條件

色譜條件：同2.2.1項。質譜條件：離子源溫度為350℃，毛細管溫度為350℃，源電壓為4 000 V，鞘氣流速為35 arb，輔助氣流速為10 arb，離子源為電噴霧離子源；掃描模式為正負離子，同時進行一級質譜全掃描、二級質譜全掃描，掃描范圍m/z50～600［13-15］。質譜離子信息見表2。

表2 質譜離子信息Tab.2 The information of mass spectrum ion

2.3.2 樣品檢測

取混合對照品溶液Ⅲ，46批樣品的供試品溶液及2.1項下陰性對照品溶液，按2.3.1項下試驗條件進樣測定。在疑似染色供試品溶液色譜中，與檸檬黃、日落黃對照品相應色譜峰呈相同的質譜特征。結果顯示，46批樣品中有5批檢出檸檬黃和日落黃。

3 討論

參照蒲黃中金胺O檢查的補充檢驗方法（批準件編號為2007007）、紅花中多種色素檢查的補充檢驗方法（批準件編號為2013006，2014016），用70%乙醇對藥材樣品進行直接提取，方法簡便快捷。

預試驗中采用了不同展開系統，二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（6∶2∶4∶0.5，V/V/V/V）和正丁醇-丙酮-乙酸乙酯-水-氨水（6∶6∶2∶2∶0.5，V/V/V/V/V）進行比較，多種色素的分離效果欠佳，嘗試前一種系統為一次展開劑，后一種系統為二次展開劑，所得薄層色譜斑點清晰，分離度佳。對溫度和相對濕度等影響因素進行了考察，結果溫度和相對濕度對薄層色譜鑒別結果無明顯影響。

本研究中46批沉香藥材樣品有5批檢出檸檬黃和日落黃。當前市場沉香染色情況較嚴重，檢出的檸檬黃和日落黃這2種染色劑均未見報道。兩者均為合成染色劑，由苯環和偶氮基團等物質縮合而成，在一定條件下可分解產生20多種具有致癌性的芳香胺類物質，會導致基因變異，進而導致病變和誘發各類惡性腫瘤等［16］。

綜上所述，本研究中所建立的方法可用于沉香中這10種非法染色劑的檢查。