高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定肉蓯蓉飲片及管花肉蓯蓉提取物中4種苯乙醇苷類成分含量*

李 洋，布比阿加爾·哈依拉提，秦亞迪，姚 軍△，袁 潔，游 林

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆第二醫(yī)學(xué)院，新疆 克拉瑪依 834000；3.和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司，新疆 和田 848000）

肉蓯蓉又名蓯蓉、地精，屬列當(dāng)科肉蓯蓉屬，以干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖入藥［1］，寄生于藜科植物梭梭和檉柳的根部，在我國(guó)主要分布于內(nèi)蒙古、青海、新疆、寧夏等西北干旱地區(qū)［2］。其最早見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品［3］，味甘、咸，性溫，歸腎、大腸經(jīng)，因具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、潤(rùn)腸通便、保肝、抗衰老、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力等功效，臨床多用于治療腎陽(yáng)虛衰、血枯便秘、女子不孕、腰膝痿軟、記憶力減退等癥狀［4-7］，素有“沙漠人參”和“藥中珍品”之美稱［8］。肉蓯蓉屬植物主要含有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、生物堿類、木質(zhì)素類等成分［9-10］，以毛蕊花糖苷和松果菊苷為代表的苯乙醇苷類成分具有壯陽(yáng)、抗衰老、抗氧化、增強(qiáng)記憶力等功效［11-15］，是肉蓯蓉屬植物的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，也是2020年版《中國(guó)藥典（一部）》肉蓯蓉項(xiàng)下質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制的指標(biāo)性成分。有研究報(bào)道了高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定肉蓯蓉屬植物苯乙醇苷類成分的含量，但僅限于肉蓯蓉藥材及飲片［16-17］。目前，關(guān)于管花肉蓯蓉提取物尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定也未見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新疆管花肉蓯蓉主要含有松果菊苷、異毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷、管花苷A這4種代表性苯乙醇苷類成分。本研究中建立了同時(shí)測(cè)定肉蓯蓉飲片及管花肉蓯蓉提取物中4種上述成分含量的HPLC法，旨在為更好地評(píng)價(jià)肉蓯蓉飲片及制訂其提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）；AB135-S型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；艾柯超純水儀系統(tǒng)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥

松果菊苷對(duì)照品（批號(hào)為S-003-01904003）、異毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)為Y-073-11803024）、毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)為M-011-02103019）、管花苷A對(duì)照品（批號(hào)為G-066-11812016），均購(gòu)于北京英萊克科技發(fā)展有限公司，含量均大于98%；乙腈、甲醇均為色譜純，甲酸為分析純，水為超純水。4批肉蓯蓉飲片（編號(hào)S1，S2，荒漠肉蓯蓉，產(chǎn)地內(nèi)蒙古；編號(hào)S3，S4，管花肉蓯蓉，產(chǎn)地新疆），均購(gòu)于烏魯木齊的4家藥店；管花肉蓯蓉提取物（編號(hào)S5，滅酶干片水提；編號(hào)S6，滅酶干片醇提；編號(hào)S7，滅酶干片醇提上樹(shù)脂），均購(gòu)自新疆和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～12 min時(shí)17%A→20%A，12～30 min時(shí)20%A→22%A，30～35 min時(shí)22%A→17%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：稱取4種對(duì)照品各適量，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液定容，制成松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度分別為1.008，1.011，012，1.012 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。量取適量，置同一10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，制成松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度分別為201.60，50.55，101.20，50.60μg/mL的混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

供試品溶液：取肉蓯蓉飲片粉末（過(guò)4號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率35 kHz）提取40 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得肉蓯蓉飲片供試品溶液。取管花肉蓯蓉提取物粉末約0.2 g，精密稱定，同法制備管花肉蓯蓉提取物供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果理論板數(shù)按松果菊苷峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Echinacoside 2.Tubuloside A 3.Acteoside 4.Isoacteoside A.Mixed reference solution B.Test solution of Cistanches Herba decoction pieces C.Test solution of Cistanche Tubulosa extractFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.5，5.0，10.0 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。回歸方程與線性范圍見(jiàn)表1。

檢測(cè)限與定量限考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比為3∶1和10∶1時(shí)的質(zhì)量濃度分別作為檢測(cè)限和定量限。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系及檢測(cè)限與定量限考察結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test，L O D and LOQ

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.31%，0.91%，1.58%，0.58%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.84%，2.18%，1.05%，1.55%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取樣品（編號(hào)S2）粉末適量，精密稱定，平行6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的平均含量分別為0.779%，0.020%，0.155%，0.074%，R S D分別為1.21%，3.12%，2.65%，2.96%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（編號(hào)S2）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的單一對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取各批樣品各適量，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）Tab.3 Results of content determination of four phenylethanol gly?cosides in the samples（%，n=3）

3 討論

本研究中采用二極管陣列檢測(cè)器，在200～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)混合對(duì)照品溶液和供試品溶液的待測(cè)成分進(jìn)行掃描，結(jié)果松果菊苷、毛蕊花糖苷在330 nm，管花苷A在331 nm，異毛蕊花糖苷在327 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。同時(shí)，參考2020年版《中國(guó)藥典（一部）》肉蓯蓉項(xiàng)下松果菊苷和毛蕊花糖苷的檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm，各成分在330 nm波長(zhǎng)處的色譜峰較多，響應(yīng)值較高，故確定最終測(cè)定波長(zhǎng)為330 nm。

從肉蓯蓉飲片含量測(cè)定結(jié)果來(lái)看，管花肉蓯蓉和荒漠肉蓯蓉中松果菊苷的含量最高，其次為毛蕊花糖苷，管花苷A和異毛蕊花糖苷的含量相對(duì)較低。4種苯乙醇苷類成分含量差異較大，且不同產(chǎn)地、同一產(chǎn)地不同批間有效成分含量差異也較大，這與藥材不同產(chǎn)地的地理環(huán)境、溫度、氣候及采收加工等因素有關(guān)，影響了植物中化學(xué)成分的積累。不同基源肉蓯蓉的化學(xué)成分種類相似，但各類成分含量不同，導(dǎo)致其功效各有側(cè)重，故應(yīng)根據(jù)功效選擇合適的基源藥材，以達(dá)到更好的臨床效果。

綜上所述，本研究中建立的方法簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確有效，可用于同時(shí)測(cè)定肉蓯蓉飲片及管花肉蓯蓉提取物中4種苯乙醇苷類成分。樣品含量測(cè)定結(jié)果可反映不同產(chǎn)地、同一產(chǎn)地不同批次的肉蓯蓉飲片及管花肉蓯蓉不同提取物的質(zhì)量水平，為制訂相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。