響應曲面法優選紫蘇葉中迷迭香酸超聲提取工藝

劉根才，華 杰

（浙江維康藥業股份有限公司，浙江 麗水 323000）

紫蘇Perilla f rutescens（L.）Britt.屬薄荷屬唇形科植物，廣泛分布于中國、日本、韓國、印度及部分東南亞國家［1］。我國有2 000多年的紫蘇栽培歷史，是栽種面積和年出口量最大的國家［2］。紫蘇的葉、莖和果實均能入藥，是衛生部“第一批藥食同源的60種作物”之一［3］。紫蘇葉具有解表散寒、行氣和胃功效，可用于治療風寒感冒、咳嗽嘔惡、妊娠嘔吐、魚蟹中毒等癥［4］。紫蘇葉中含有多種生物活性成分，包括揮發油類、黃酮類、酚酸類等，迷迭香酸在酚酸類成分中含量最高［5-6］，具有抗炎、抑菌、抗抑郁、抗腫瘤等作用［7］。迷迭香酸的提取方法較多，包括微波提取、超聲提取、熱水浸提、有機溶劑提取、回流提取等［8-12］。響應曲面法能準確表達考察指標與單因素之間的關系，可快速得出多因素影響的最優工藝條件。本研究中采用響應曲面法優選迷迭香酸的超聲提取工藝。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；ME303型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；KQ-500DB型超聲清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；DFY-600型搖擺式高速萬能粉碎機（永康式速鋒工貿有限公司）；循環水式多用真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；T-1000型電子秤（上海浦春計量儀器有限公司）；酒精計（河北省武強縣滏陽儀表廠）。

1.2 試藥

迷迭香酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111871-201706，含量90.5%）；甲醇、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。紫蘇葉（浙江惠松制藥有限公司，批號為200930）。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件［13-14］

色譜柱：Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（40∶60，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：330 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

取迷迭香酸對照品10.0 mg，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇超聲（功率500 W，頻率40 kHz，下同）提取30 min，放冷，加甲醇定容，搖勻，即得質量濃度為1.0 mg/mL的對照品溶液。取藥材樣品粉末（過80目篩）5.00 g，精密稱定，置帶塞錐形瓶中，用乙醇超聲提取，放冷，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密量取對照品溶液，倍比稀釋，制成質量濃度分別為0.015 6，0.031 3，0.062 5，0.125，0.25 mg/mL的系列對照品溶液。各精密量取10μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以迷迭香酸質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=95 544X+391.66（R2=0.998 9，n=5）。結果表明，迷迭香酸質量濃度在0.015 6～0.25 mg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限考察：分別精密量取2.1.2項下對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比10∶1和3∶1時的質量濃度作為檢測限和定量限。結果迷迭香酸的檢測限和定量限分別為0.001 4 mg/mL和0.004 8 mg/mL。

精密度試驗：取2.1.2項下對照品溶液適量，按2.1.1項下色譜條件連續測定3 d（每天連續2次）及1 d內連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果日間和日內精密度試驗中迷迭香酸峰面積的R S D分別為1.56%（n=3）和0.49%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，1，2，4，8 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果迷迭香酸峰面積的RSD為0.92%（n=5），表明供試品溶液在室溫放置8 h內基本穩定。

重復性試驗：取藥材樣品粉末適量，精密稱定，共5份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果迷迭香酸峰面積的RSD為1.22%（n=5），表明方法重復性良好。

2.2 提取率計算

按公式［提取率（%）=c×n×V/M×100%］計算迷迭香酸的提取率［15］。式中，c為迷迭香酸質量濃度（mg/mL），n為濾液稀釋倍數，V為濾液體積（mL），M為藥材樣品粉末質量（g）。

2.3 單因素試驗

乙醇體積分數：當超聲60 min、料液比為1∶10、乙醇體積分數為30%～40%時，迷迭香酸的提取率呈上升趨勢，在40%乙醇時出現最大值，其后呈先下降后上升趨勢，但均未超過最大值（見圖1）。故以40%乙醇進行后續試驗。

圖1 乙醇體積分數對迷迭香酸提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of ros?marinic acid

料液比：以40%乙醇超聲60 min、料液比為1∶5～1∶10時，迷迭香酸的提取率呈上升趨勢，并在1∶10時出現最大值，其后呈下降趨勢（見圖2）。故以料液比1∶10進行后續試驗。

圖2 料液比對迷迭香酸提取率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of rosmarinic acid

超聲時間：乙醇體積分數為40%、料液比為1∶10、超聲時間為15～60 min時，迷迭香酸提取率呈緩慢上升趨勢，并在60 min時出現最大值，其后呈下降趨勢（見圖3）。故以超聲時間60 min進行后續試驗。

圖3 超聲時間對迷迭香酸提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of rosmarinic acid

2.4 響應曲面優化試驗

2.4.1 響應曲面模型的建立和顯著性檢驗

依據Box-Behnken響應曲面法，在單因素試驗基礎上，以迷迭香酸提取率為響應值，以乙醇體積分數（因素A）、料液比（因素B）、超聲時間（因素C）為考察因素，采用Design Expert 8.0軟件設計三因素三水平的響應曲面試驗。因素與水平見表1，試驗設計見表2。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and levels

由表2可知，17個試驗點中12個為分析原因點，其余5個為中心點，用來估計試驗誤差。以Design Expert 8.0軟件進行回歸分析，進行多元回歸擬合，得到迷迭香酸提取率（Y）對因素A、因素B、因素C的二次多項回歸方程：Y=0.62-5.625×10-3A-0.019B+0.019C-6.5×10-3A B-0.027AC+2.25×10-3BC-0.062A2-0.061B2-0.048C2。對表2所得回歸模型進行方差分析，結果見表3。

表2 試驗設計Tab.2 Design of the test

由表3可知，模型的P＜0.000 1，說明所得二次多項模型有極顯著性；失擬項P=0.462 5＞0.05，說明失擬項無顯著性；模型的R2adj=0.949 7，說明擬合程度好，試驗方法可靠，該模型可用于紫蘇葉中迷迭香酸提取工藝條件的預測和分析。由回歸模型中各項P值可知，一次項B和C對迷迭香酸的提取率有極顯著影響，A無顯著影響；交互項AC對迷迭香酸的提取率影響極顯著，AB、BC無顯著影響；二次項A2，B2，C2對迷迭香酸的提取率影響極顯著。由回歸模型單因素F值可知，對迷迭香酸提取率影響由大至小為B＞C＞A。結合回歸模型各因素P值和F值可知，以迷迭香酸提取率為響應值時，各因素影響大小順序為B＞C＞A。

2.4.2 響應面分析

利用Design Expert 8.0軟件對表3的數據進行二項多次回歸擬合，建立響應曲面，比較2個因素交互作用對迷迭香酸提取率的影響。

表3 方差分析結果Tab.3 ANOVA results

當超聲60 min，乙醇體積分數≤30%時，迷迭香酸提取率隨料液比的增大先增加后減小，在料液比約為1∶10和乙醇體積分數約為40%時出現最大值，且料液比對提取率的影響大于乙醇體積分數。詳見圖4。

圖4 料液比和乙醇體積分數對迷迭香酸提取率的影響a.Response surface plot b.Contour plotFig.4 Effects of material-to-liquid ratio and ethanol volume fraction on the extraction rate of rosmarinic acid

當料液比為1∶10時，隨著乙醇體積分數和超聲時間的增加，迷迭香酸提取率逐漸增加，在乙醇體積分數約為40%和超聲約60 min時出現最大值，且超聲時間對提取率的影響大于乙醇體積分數。詳見圖5。

圖5 乙醇體積分數和超聲時間對迷迭香酸提取率的影響a.Response surface plot b.Contour plotFig.5 Effects of ethanol volume fraction and ultrasonic time on the extraction rate of rosmarinic acid

當乙醇體積分數為40%，料液比較小時，超聲時間在15～60 min間增加時，迷迭香酸提取率呈上升趨勢，約在60 min時出現最大值，且料液比對提取率的影響大于超聲時間。詳見圖6。

圖6 料液比和超聲時間對迷迭香酸提取率的影響a.Response surface plot b.Contour plotFig.6 Effects of material-to-liquid ratio and ultrasonic time on the extraction rate of rosmarinic acid

2.4.3 驗證試驗

響應面分析得到迷迭香酸提取的最優條件為，39.16%乙醇超聲63.21 min，料液比為1∶9.28，迷迭香酸提取率達0.62%。考慮到試驗的可行性，將最優條件修正為39%乙醇超聲63 min，料液比為1∶9。在修正條件下，取藥材樣品粉末，精密稱定，進行3次平行試驗，得到迷迭香酸的實際平均提取率為0.61%，RSD為1.61%，與理論值比較誤差為0.009%。

3 討論

紫蘇葉的藥食用價值均較高，所含迷迭香酸生物活性廣泛，其藥理作用和來源的天然性在保障人體健康方面潛力較大，是天然的抗氧化劑。且迷迭香酸性質穩定，不易分解，克服了目前市面上許多抗氧化劑性質不穩定的問題，在抗氧化領域應用前景良好。響應曲面法是目前活性成分提取、分離運用較多的方法，操作簡便，所得數據準確，具有代表性。本試驗中在單因素試驗基礎上，采用響應曲面法對紫蘇葉中迷迭香酸的超聲提取工藝進行了優化，得到最優條件為乙醇體積分數39%，超聲時間63 min，料液比1∶9。在此條件下，迷迭香酸的提取率理論值為0.62%，實際值為0.61%，兩者相對誤差較小，證明采用響應曲面法得到的超聲提取紫蘇葉中迷迭香酸的最優工藝條件較準確，有實用價值。