基于信息熵的正交試驗優(yōu)選苦柏洗劑提取工藝*

盧 興，王艷寧，黃 玲，朱海燕，張 迪，張韶湘，黎為能

（1.廣西壯族自治區(qū)南寧市第一人民醫(yī)院，廣西 南寧 530022；2.云南省昆明市中醫(yī)院，云南 昆明 650504；3.右江民族醫(yī)學院，廣西 百色 533099）

苦柏洗劑是南寧市第一人民醫(yī)院協(xié)定處方，由黃柏、苦參、紫草、澤蘭、地膚子等8味中藥材組方，具有清熱燥濕、殺蟲止癢等功效。其水煎液外洗，可治療濕疹、手腳癬、皮膚瘙癢等皮膚疾病，但其煎煮工藝尚無系統(tǒng)性研究報道。正交試驗廣泛應用于制劑生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，方法簡單、重復性好［1-2］，但其評價指標多為人工賦權，有欠客觀，信息熵賦權法中的多評價指標較好地彌補了該缺點［3-4］。信息熵賦權是根據(jù)系統(tǒng)某個屬性的變異程度大小賦權，其屬性變異程度與該屬性的信息熵呈反比，其提供的信息量與權重呈正比［5］。本研究中以加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)為考察因素，以鹽酸小檗堿含量及得膏率為綜合評價指標，計算各指標的信息熵及權重系數(shù)，并進行綜合評分，對苦柏洗劑水提取工藝進行優(yōu)選。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；FA2004N型電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；101-3型電熱鼓風干燥箱（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）；LD4-2A型低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110713-201814，含量86.7%）；甲醇、乙腈、無水乙醇均為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，水為超純水；苦參藥材（批號為2002022）、黃柏藥材（批號為1903114）、紫花地丁藥材（批號為1904011）、白鮮皮藥材（批號為1908060）、土茯苓藥材（批號為1904046）、澤蘭藥材（批號為1905030）、紫草藥材（批號為1908005），均購自廣西張益堂中藥飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 得膏率測定［6］

取樣品貯備液80 mL，4 000 r/min離心15 min，精密量取上清液50 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃下烘干至恒重，取出，置干燥器中30 min，迅速稱定干膏質(zhì)量，計算得膏率。得膏率（%）=浸膏質(zhì)量×（濃縮液總體積/量取液體積）/藥材質(zhì)量×100%。

2.2 鹽酸小檗堿含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：GL Science Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.033 mol/L磷酸二氫鉀溶液（40∶60，V/V；pH 6.33）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：345 nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

2.2.2 溶液制備

取干燥至恒重的鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液。取浸膏［7-8］，加水溶解并定容至10 mL，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按苦柏洗劑處方工藝制備缺黃柏的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性與專屬性試驗：取2.2.2項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果分離度＞1.5，理論板數(shù)以鹽酸小檗堿計不低于3 500，陰性對照品溶液色譜中，在與鹽酸小檗堿對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Berberine hydrochloride A.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.2.2項下對照品溶液0.3，0.6，0.8，1.0，1.2，1.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得系列對照品溶液。精密量取20μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=101 136X+57 101（r=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在7.5～37.5μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

定量限與檢測限考察：分別精密量取2.2.2項下對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比為10∶1和3∶1時的質(zhì)量濃度分別記作定量限和檢測限。結(jié)果鹽酸小檗堿的定量限和檢測限分別為1.86μg/mL和0.56μg/mL。

精密度試驗：取2.2.2項下對照品溶液適量，按2.2.1項下色譜條件連續(xù)3 d測定及1 d內(nèi)連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果日間和日內(nèi)精密度試驗中鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.78%（n=3）和1.31%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，1，8，24，48，72 h，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的R S D為2.40%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：精密量取樣品適量，共6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RS D為2.49%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的鹽酸小檗堿對照品溶液，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.3 正交試驗

2.3.1 試驗設計

采用L9（34）正交表進行試驗設計，以加水量（因素A）、煎煮時間（因素B）、煎煮次數(shù)（因素C）為考察因素［9］，應用信息熵理論對鹽酸小檗堿含量、得膏率進行矩陣處理，計算得兩者的客觀權重系數(shù)［10-11］，再以這2個系數(shù)的綜合評分為評價指標。因素與水平見表2，正交試驗設計與結(jié)果見表3。

表2 因素與水平Tab.2 The factors and levels

表3 正交試驗設計與結(jié)果（n=9）Tab.3 Design and results of the orthogonal test（n=9）

2.3.2 數(shù)據(jù)處理［12-13］

1）建立原始評價矩陣（X）

以“小檗堿含量、得膏率”的結(jié)果建立原始評價指標矩陣（X）。

2）建立“概率”矩陣

根據(jù)公式計算Pij，將原始評價矩陣轉(zhuǎn)為“概率”矩陣（P）。

3）各指標的信息熵值及權重系數(shù)

由“概率”矩陣計算各項指標的信息熵值（Hi）及權重系數(shù)（Wi）。

4）綜合評價

對“概率”矩陣（P）的數(shù)值進行加權處理，計算綜合評分（Mi），Mi=P1i W1+P2iW2，其中，P1i為“概率”矩陣（P）中第1行第i列數(shù)值，W1為小檗堿含量的權重系數(shù)即（0.726 5）；P2i為“概率”矩陣（P）中第2行第i列數(shù)值，W2為得膏率的權重系數(shù)（即0.273 5）。結(jié)果見表3。

5）方差分析

依據(jù)綜合評分（Mi）對正交試驗結(jié)果進行極差分析和方差分析可知，3個因素對鹽酸小檗堿含量和得膏率綜合評分值影響大小排序為煎煮次數(shù)＞煎煮時間＞加水量，但對綜合評分均無顯著影響（P＞0.05），故選擇A2B3C3為苦柏洗劑的最佳提取工藝，即加10倍量水，煎煮3次，每次1.5 h。詳見表4。

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 ANOVA results

2.4 驗證試驗

按優(yōu)化后的提取工藝，以處方1/10量準確稱取藥材3份，平行試驗3次，結(jié)果得膏率、鹽酸小檗堿含量、綜合評分的RSD均小于2.35%。詳見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of the validation test（n=3）

3 討論

3.1 流動相及檢測波長選擇

預試驗中以2020年版《中國藥典》（一部）“黃柏”含量測定項下方法測定鹽酸小檗堿含量，但分離效果欠佳，可能由于中藥復方制劑水提取液的成分復雜且易相互干擾。因而在選擇流動相時，參考文獻［14］中的方法，用乙腈-0.033 moL/L磷酸二氫鉀（40∶60，V/V）為流動相，并調(diào)pH為6.33，結(jié)果目標成分峰峰形對稱，且與其他成分峰之間分離良好。在選擇測定波長時，進行200～700 nm全波長掃描，結(jié)果265 nm和345 nm波長處均有明顯吸收，但345 nm波長處的其他成分峰產(chǎn)生的干擾較小，故選擇345 nm為檢測波長。

3.2 評價指標選擇

本研究中選擇鹽酸小檗堿為提取工藝的含量測定指標，因黃柏是苦柏洗劑的君藥之一。現(xiàn)代藥理學研究表明，黃柏所含鹽酸小檗堿對溶血性鏈球菌、葡萄球菌等細菌及部分常見致病性真菌和流感病毒等病原體均有一定抑制作用［15］。但中藥成分復雜，以單一指標評價提取工藝有一定局限，而結(jié)合得膏率，以多指標評價中藥提取工藝，更具合理性［16］。

3.3 評價指標處理

本研究中的評價指標為鹽酸小檗堿含量和得膏率。預試驗中按60%和40%給上述2個指標賦權，但通過應用信息熵賦權法，將原始評價指標轉(zhuǎn)換成“概率”矩陣計算信息熵值及權重系數(shù)，得到2個指標的權重系數(shù)分別為72.65%和27.35%，說明主觀賦權與應用信息熵賦權間有一定差異。信息熵賦權法是基于試驗數(shù)據(jù)，客觀地反映試驗條件對結(jié)果的影響，能較真實地反映試驗數(shù)據(jù)的變化，與主觀賦權相比更精確、客觀和科學［17］。

從方差分析結(jié)果來看，3個因素均對結(jié)果無顯著影響，結(jié)合極差分析結(jié)果及綜合評分得分，從節(jié)約能耗的角度來看，A2B3C3為最佳提取工藝，A2B1C3也不失為較優(yōu)方案。今后將結(jié)合臨床療效對2個工藝進行考察。另外，因中藥有效成分的物質(zhì)基礎較復雜，應進行多成分測定及評價才可能在提取過程中盡可能多地保留有效成分［18-19］。本研究中以鹽酸小檗堿含量與得膏率為考察指標，結(jié)果較局限，還應增加苦參堿、氧化苦參堿等有效成分的考察，以完善苦柏洗劑的提取工藝。

綜上所述，基于信息熵賦權法優(yōu)選的苦柏洗劑水提工藝穩(wěn)定、可行。