新疆阿魏乙酸乙酯部位對S-180腹水瘤模型小鼠的影響*

伊麗米熱·阿布都外力，張海英，趙生俊

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830000；3.新疆中藥炮制研究重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830000）

阿魏為傘形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen或阜康阿魏Fer ul a fukanensisK.M.Shen的樹脂［1］，主要分布在伊朗、阿富汗，以及哈薩克斯坦等中亞地區(qū)［2］，在我國主要分布在新疆，具有明顯的地域特色。阿魏最早記載于《新修本草》，自古就從中亞及周邊國家進口［3］。自沈冠冕發(fā)現(xiàn)新疆伊犁、阜康地區(qū)有豐富的阿魏藥材資源后，我國實現(xiàn)了自給自足，結(jié)束了長期依賴進口的局面。新疆民間維吾爾族和哈薩克族常用阿魏治療腹部腫塊、食積不化、胃脘脹滿等證［4］。阿魏具有抑制腫瘤細胞生長、促進凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性、抑制血管新生等作用［5-8］，且抗炎抗氧化作用較強，有較好的藥用價值。本課題組的前期研究表明，新疆阿魏及其含藥血清對結(jié)腸癌、肝癌、胃癌細胞的增殖具有明顯抑制作用，對S-180腹水瘤的生長也有明顯抑制作用［9-10］，且阿魏乙酸乙酯部位抗腫瘤效果優(yōu)于其石油醚、正丁醇和水部位。本研究中探討了新疆阿魏乙酸乙酯部位對模型小鼠S-180腹水瘤的抑制作用及其免疫功能的影響，為新疆阿魏藥材的研發(fā)與利用提供了參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥、動物與細胞

儀器：371型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SW-CJ-2F型超凈工作臺（美國Airtech公司）；TDI-5-A型離心機（德國Eppendorf公司）；IX71-12FL/PH型顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：RPMI 1640培養(yǎng)基（批號為2102002）、胎牛血清（FBS，批號為1850107），均購自以色列Biological Industries公司；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，批號為AF29511323），青霉素-鏈霉素雙抗溶液（批號為J200012），均購自美國Hyclone實驗室；順鉑注射液（江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司，批號為190402）；新疆阿魏樹脂（批號為2019002，由新疆伊犁哈薩克自治州藥品檢驗所提供并鑒定為正品）。

動物：健康清潔級KM小鼠120只，雌雄各半，4～6周齡，體質(zhì)量（20±4）g，均購自新疆疾病預(yù)防控制中心動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（新）2005-006。飼養(yǎng)于無病原體實驗動物中心，溫度（22±1）℃，相對濕度40%～70%，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進行實驗。

細胞：小鼠S-180細胞株（中國科學(xué)院上海生物細胞庫）。

1.2 方法

阿魏乙酸乙酯部位的制備：取阿魏樹脂適量，用5倍量95%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并濾液，濃縮為稠浸膏，即得乙醇提取物。取乙醇提取物，加入硅藻土適量，攪拌均勻，加入5倍體積石油醚，超聲（功率100 W，頻率35 kHz，下同）提取30 min，濾過，重復(fù)操作2次，合并濾液，濾液減壓回收，得石油醚部位。待殘渣揮散至無醚味，精密稱定質(zhì)量，加入5倍量乙酸乙酯，超聲提取30 min，濾過，重復(fù)操作2次，合并濾液，濾液減壓回收，得乙酸乙酯部位。取乙酸乙酯部位適量，加入無水乙醇，超聲助溶，攪拌，加食用油稀釋、分散均勻，加入吐溫80，配制所需給藥劑量。

細胞培養(yǎng)：取小鼠S-180細胞株適量，含1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液和10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的S-180細胞株適量，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用PBS清洗，以生理鹽水調(diào)細胞密度至2×106mL-1，無菌條件下以每只0.4 mL接種于小鼠腹腔內(nèi)，7～9 d后，可觀察到小鼠腹部膨大、腹水。無菌條件下抽取小鼠腹水適量，1 000 r/min離心5 min，即得實驗細胞。

建模、分組及給藥：將120只小鼠隨機分為正常對照組（等體積溶劑），模型組（等體積溶劑），順鉑組（5 mg/kg）及阿魏乙酸乙酯部位低、中、高劑量組（實驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組，給藥劑量以生藥計為1.0，2.0，3.0 g/kg），各20只。除正常對照組外，取實驗細胞，密度調(diào)整為2×106mL-1，以每只0.4 mL接種于小鼠腹腔內(nèi)復(fù)制S-180腹水瘤小鼠模型。建模成功后，各組均灌胃給予相應(yīng)藥物或溶劑。每天1次，連續(xù)10 d。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察小鼠行為。給藥第5天開始量取小鼠腹圍，每天1次，并記錄數(shù)據(jù)。末次給藥后，每組另取10只小鼠，予常規(guī)飲食飲水，觀察死亡情況，并記錄生存時間。每組10只小鼠，于末次給藥1 h后，稱取體質(zhì)量。處死小鼠，抽取腹水，量取腹水體積。用等體積生理鹽水稀釋，顯微鏡下觀察細胞密度。取出胸腺和脾臟，分別稱取質(zhì)量，計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾（或胸腺）指數(shù)（g/kg）=脾（或胸腺）質(zhì)量/體質(zhì)量×1 000。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠日常行為和生存時間

模型組小鼠食欲減退，精神狀態(tài)欠佳，日常活動較少，接種15 d時，腹部明顯增大，食欲不振，連續(xù)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，至接種17 d，全部死亡；平均生存時間（16.2±1.5）d。實驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組小鼠腹部增大不明顯，飲食活動正常，精神狀態(tài)均良好，小鼠開始出現(xiàn)死亡時間較模型組晚，實驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組分別于第19，21，23天全部死亡，平均生存時間分別為（18.2±1.8）d、（19.8±2.2）d、（21.4±1.6）d，均顯著長于模型組（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 新疆阿魏乙酸乙酯部位對S-180腹水瘤小鼠生存時間的影響Fig.1 Effect of ethyl acetate part from F e rula sinkiange nsis on survival time of model mice

2.2 小鼠腹圍、腹水量

模型組小鼠腹水均為血性腹水，量較多，實驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組少見血性腹水，多為乳白色腹水，量較少。顯微鏡下可見，模型組細胞密度最大，順鉑組及實驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組細胞密度顯著減小。與模型組比較，順鉑組及實驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組小鼠腹圍及腹水量均顯著減少（P＜0.05）。詳見表1及圖2。

圖2 各組小鼠腹水細胞密度（×40）A.Model group B.Experiment groupⅠ C.Experiment groupⅡ D.Experiment groupⅢ E.Cisplatin groupFig.2 Cell density of ascites of mice in each group（×40）

表1 各組小鼠腹圍、腹水量比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of abdominal circumference，ascites amount of mice in each group（±s，n=10）

表1 各組小鼠腹圍、腹水量比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of abdominal circumference，ascites amount of mice in each group（±s，n=10）

注：與模型組比較，#P＜0.05。表2同。Note：Compared with those in the model group，#P ＜ 0.05（for Tab.1-2）.

腹水量（mL）0.0±0.0 11.8±1.0 2.6±0.9#8.3±1.0#7.3±1.2#5.6±1.2#組別正常對照組模型組順鉑組實驗Ⅰ組實驗Ⅱ組實驗Ⅲ組腹圍（cm）7.2±0.5 10.0±0.7 6.5±0.6#9.6±0.6 8.9±0.9#8.6±1.0#

2.3 小鼠體質(zhì)量、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)

與正常對照組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，順鉑組小鼠體質(zhì)量顯著降低，實驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組小鼠脾質(zhì)量及實驗Ⅱ組、Ⅲ組小鼠胸腺質(zhì)量均顯著增加，順鉑組和實驗Ⅱ組、Ⅲ組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of weight，spleen index and thymus index of mice in each group（±s，n=10）

表2 各組小鼠體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of weight，spleen index and thymus index of mice in each group（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05。Note：Compared with those in the control group，*P＜0.05.

組別正常對照組模型組順鉑組實驗Ⅰ組實驗Ⅱ組實驗Ⅲ組胸腺指數(shù)（g/kg）2.09±0.22 1.65±1.40*2.21±2.07#1.82±1.20 3.56±1.47#4.78±1.21#體質(zhì)量（g）33.56±3.27 36.28±4.70 22.64±2.98#38.42±3.78 33.74±4.56 31.36±4.34脾質(zhì)量（g）0.16±0.03 0.17±0.08 0.15±0.03 0.21±0.08#0.23±0.03#0.26±0.04#脾指數(shù)（g/kg）4.77±0.31 4.69±0.87 6.63±0.30#5.47±0.88 6.82±1.99#8.29±2.23#胸腺質(zhì)量（g）0.07±0.02 0.06±0.02 0.05±0.04 0.07±0.05 0.12±0.02#0.15±0.07#

3 討論

有研究表明，S-180實體瘤模型小鼠給予阿魏乙酸乙酯部位后，其胸腺和脾臟均明顯增大增厚，提示阿魏乙酸乙酯部位對免疫器官及其功能有一定影響［5］。故本研究中以S-180腹水瘤小鼠為實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

腹腔積液是惡性腫瘤侵襲、遷移的主要表現(xiàn)，臨床不易控制。血性腹腔積液的發(fā)病原因復(fù)雜，常表現(xiàn)為在腹腔積液中紅細胞含量增多且伴有出血［11-12］。本研究中觀察到模型組小鼠的腹水量大，且多為血性腹腔積液，提示其病情發(fā)展速度較快，各給藥組小鼠血性腹水出現(xiàn)較少，多為乳白色或淡黃色腹水。腹腔積液會導(dǎo)致腹部脹滿、疼痛、食欲減退等癥狀，合并惡性腹腔積液時常提示病情已至晚期，生存時間僅3～6個月。實體瘤評價抗腫瘤藥效多以腫瘤質(zhì)量為指標(biāo)，而腹水瘤模型動物的結(jié)局是死亡，故多用生存時間來評價藥效［13］。本研究結(jié)果表明，新疆阿魏乙酸乙酯部位可明顯減少模型小鼠的腹水量，延長其生存時間。

脾與胸腺是機體重要的免疫器官。脾臟是體內(nèi)最大的淋巴器官，胸腺是T淋巴細胞分化成熟的免疫器官，故脾指數(shù)和胸腺指數(shù)可作為衡量免疫功能的指標(biāo)。本研究中，與正常對照組比較，模型組小鼠的胸腺、脾臟質(zhì)量無明顯改變，實驗Ⅱ組、Ⅲ組小鼠胸腺、脾臟的質(zhì)量明顯增加，且脾臟出現(xiàn)顏色變深，尖端鈍圓的現(xiàn)象。提示阿魏乙酸乙酯部位對小鼠的免疫功能有一定影響。但本研究未進一步進行細胞因子水平、免疫指標(biāo)的測定，故阿魏乙酸乙酯與S-180腹水瘤模型小鼠免疫功能的相關(guān)性還有待深入研究。

綜上所述，新疆阿魏乙酸乙酯提取物可減少S-180腹水瘤模型小鼠的腹水，延長其生存期，并對其免疫功能有一定影響。