利巴韋林滴眼液抑菌效力測(cè)試

劉 崢，易秋艷，劉 陽(yáng)（通信作者）

（1四川省藥品技術(shù)檢查中心<四川省疫苗檢查中心>藥品生產(chǎn)檢查組 四川 成都 610031）

（2四川省藥品檢驗(yàn)研究院<四川省醫(yī)療器械檢測(cè)中心>微生物室 四川 成都 610000）

利巴韋林滴眼液適用于單純皰疹病毒性角膜炎，利巴韋林為抗非逆轉(zhuǎn)錄病毒藥，不具有充分的抗菌作用，在生產(chǎn)過(guò)程中添加適量的抑菌劑可防止污染微生物而變質(zhì)。配方選擇抑菌劑時(shí)應(yīng)綜合考察其穩(wěn)定性、安全性、配伍可行性、抑菌效果等多方面的因素[1-3]。苯扎溴銨是滴眼劑生產(chǎn)中常用的抑菌劑。2020年版《中國(guó)藥典》[4]規(guī)定“抑菌劑的抑菌效力在貯存過(guò)程中有可能因藥物的成分或包裝容器等因素影響而變化，因此，應(yīng)驗(yàn)證成品制劑的抑菌效力在效期內(nèi)不因貯藏條件而降低。”本文對(duì)市售兩批含苯扎溴銨0.2%（V/V）的利巴韋林滴眼劑分別人工污染5種標(biāo)準(zhǔn)菌株，計(jì)算培養(yǎng)不同時(shí)間后存活菌數(shù)的常用對(duì)數(shù)值相對(duì)于初始值減少的量來(lái)測(cè)試滴眼劑對(duì)相應(yīng)菌株的抑菌效力。

1.資料與設(shè)備

1.1 一般資料

利巴韋林滴眼液，批號(hào)：200417，規(guī)格：8 mL:8 mg，生產(chǎn)單位：安徽環(huán)球藥業(yè)股份有限公司。

利巴韋林滴眼液，批號(hào)：20190124，規(guī)格：8 mL:8 mg，生產(chǎn)單位：長(zhǎng)春長(zhǎng)慶藥業(yè)集團(tuán)有限公司。

兩批滴眼液中抑菌劑苯扎溴銨的含量均為0.2%（V/V）。

1.2 試劑試藥

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，以下簡(jiǎn)稱(chēng)TSA（批號(hào)190704）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，以下簡(jiǎn)稱(chēng)SDA（批號(hào)200310）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)200310）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)180228）、pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)181026）均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供。培養(yǎng)基適用性檢查試驗(yàn)結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》[4]要求。

1.3 試驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌staphylococcus aureus[CMCC（B）26 003]第3代；表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis [CMCC（B）26 069]第3代；銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC（B）10 104]第3代；白色念珠菌Candida albicans[CMCC（F）98 001]第3代；黑曲霉Aspergillus niger[CMCC（F）98 003]第3代。來(lái)源均為中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)買(mǎi)的0代凍干菌，自行傳代培養(yǎng)至所需代數(shù)。

1.4 設(shè)備

Thermo Class A Ⅱ生物安全柜、BINDER BD 720生物培養(yǎng)箱、BINDER KB 400生物培養(yǎng)箱、三鑫YXQ-WF32D壓力蒸汽滅菌鍋、IKA渦旋混合儀基本型MS3。

2.方法

2.1 存活菌數(shù)測(cè)定方法的確定

為準(zhǔn)確測(cè)定供試品中加入試驗(yàn)菌的存活菌數(shù)，應(yīng)進(jìn)行存活菌數(shù)測(cè)定方法適用性試驗(yàn)。取200417批及20190124批滴眼液按《中國(guó)藥典》[4]通則1105試驗(yàn)，回收率不得低于50%。

2.1.1 試驗(yàn)過(guò)程 實(shí)驗(yàn)共設(shè)四個(gè)組 試驗(yàn)組、菌液對(duì)照組、供試品對(duì)照組和陰性對(duì)照組。

試驗(yàn)組：細(xì)菌計(jì)數(shù)取原液、1:10、1:20、1:50供試液10 mL分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌三種試驗(yàn)菌的菌懸液0.1 mL（5 000～10 000 cfu/mL），充分混勻后，分別取1 mL置直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過(guò)45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂混勻，待瓊脂凝固后，倒置放入33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)（細(xì)菌計(jì)數(shù)用金黃色葡萄球菌進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)）。

真菌計(jì)數(shù)取供試品原液、1:10供試液10 mL分別加入白色念珠菌、黑曲霉兩種試驗(yàn)菌的菌懸液0.1 mL（5 000～10 000 cfu/mL），充分混勻后，分別取1 mL置直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過(guò)45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基混勻，待瓊脂凝固后，倒置放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)。

菌液對(duì)照組：取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌三種試驗(yàn)菌的菌懸液0.1 mL（5 000～10 000 cfu/mL），充分混勻后，分別取1 mL置直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過(guò)45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂混勻，待瓊脂凝固后，倒置放入33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL分別加入白色念珠菌、黑曲霉兩種試驗(yàn)菌的菌懸液0.1 mL（5 000～10 000 cfu/mL），充分混勻后，分別取1 mL置直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過(guò)45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基混勻，待瓊脂凝固后，倒置放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)。五種試驗(yàn)菌均平行制備2個(gè)平皿。

供試品對(duì)照組：細(xì)菌計(jì)數(shù)取原液、1:10、1:20、1:50供試液10 mL加入pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，充分混勻后，分別取1 mL置兩個(gè)直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過(guò)45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂混勻，待瓊脂凝固后，倒置放入33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。真菌計(jì)數(shù)取供試品原液10 mL、1:10供試液加入pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，充分混勻后，分別取1 mL置兩個(gè)直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過(guò)45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基混勻，待瓊脂凝固后，倒置放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)。

陰性對(duì)照組：細(xì)菌計(jì)數(shù)取1 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液置直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過(guò)45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置并按規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。真菌計(jì)數(shù)取1mlpH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液置直徑90 mm無(wú)菌平皿中，并注入15～20 mL溫度不超過(guò)45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置并按規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。

2.1.2 試驗(yàn)結(jié)果 兩批樣品按《中國(guó)藥典》[4]方法試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1、2。取原液、1:10、1:20供試液分別加金黃色葡萄球菌試驗(yàn)，回收率均小于50%，上述稀釋級(jí)供試液均不適用于細(xì)菌計(jì)數(shù)；取原液加白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)，回收率均小于50%，原液不適用于真菌計(jì)數(shù)。另取1:50供試液加金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌試驗(yàn)，回收率均大于50%；另取1:10供試液加白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)，回收率均大于50%。

表1 200417批菌落計(jì)數(shù)測(cè)定結(jié)果

計(jì)算公式：試驗(yàn)組菌回收率=［（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）÷菌液對(duì)照組菌落數(shù)］×100%。

表2 20190124批菌落計(jì)數(shù)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)以上結(jié)果，存活菌數(shù)測(cè)定方法可確定為：按傾注法，取1:50供試液進(jìn)行細(xì)菌數(shù)的測(cè)定；取1:10供試液進(jìn)行真菌數(shù)的測(cè)定。兩批滴眼劑按此方法試驗(yàn)，5種標(biāo)準(zhǔn)菌的回收率均大于50%，方法成立。

2.2 抑菌效力測(cè)定方法

2.2.1 菌懸液的制備及濃度 取經(jīng)33 ℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌的胰酪大豆胨瓊脂平板，分別用一次性接種環(huán)刮取適量菌體至0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋并制成每1 mL含菌數(shù)約為108～109cfu的菌懸液。用傾注法測(cè)得菌懸液的濃度分別為4.2×109、2.2×109、8.4×108cfu/mL。取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂平板，用一次性接種環(huán)刮取適量菌體至0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋并制成每1 mL含菌數(shù)約為107cfu的菌懸液。用傾注法測(cè)得菌懸液的濃度為9.4×107cfu/mL。經(jīng)25 ℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)物，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后用無(wú)菌吸管將孢子懸液吸出至無(wú)菌試管內(nèi)，加入適量的含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)約為107cfu的孢子懸液。用傾注法測(cè)得濃度為8.0×106cfu/mL。

2.2.2 供試品接種 按《中國(guó)藥典》[4]中<1121抑菌效力檢查法>規(guī)定，采取原位接種的方式，將試驗(yàn)菌直接接種于供試品容器中進(jìn)行試驗(yàn)，菌液的體積不超過(guò)供試品體積的1%。每批樣品取10支（8 mL/支）分別接種2.2.1的5種菌液（1×107～1×108cfu/mL）各80 μl，每種試驗(yàn)菌各接種2支，渦旋混勻，25 ℃避光放置。

3.結(jié)果

3.1 存活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果

分別在6 h、24 h、7 d、14 d、28 d取接種后25 ℃放置的滴眼劑按2.1確定的計(jì)數(shù)方法測(cè)定樣品中的存活菌數(shù)，以菌數(shù)變化情況評(píng)價(jià)其抑菌效力。計(jì)算每一種試驗(yàn)菌在供試品中的存活菌數(shù)，并換算成lg值，與供試品中0 h接種菌數(shù)的lg值或前一測(cè)定時(shí)間點(diǎn)存活菌數(shù)的lg值比較，計(jì)算經(jīng)過(guò)不同放置時(shí)間后的對(duì)數(shù)下降值，結(jié)果見(jiàn)表3、4。兩批樣品細(xì)菌組在接種6 h后活菌數(shù)減少的lg值均大于2，24 h后減少的lg值均大于3，至28 d均未恢復(fù)生長(zhǎng)；真菌組供試品在接種7 d后活菌數(shù)減少的lg值均大于2，至28 d均無(wú)增加趨勢(shì)。

表3 200417批接種后不同時(shí)間存活菌數(shù)cfu/mL及相對(duì)0 h減少值（lg）

表4 20190124批接種后不同時(shí)間存活菌數(shù)及減少值cfu/mL（lg）

4.討論

4.1 實(shí)驗(yàn)菌株的選擇

按《中國(guó)藥典》[4]要求，測(cè)試滴眼劑的抑菌效力應(yīng)選擇的標(biāo)準(zhǔn)菌株為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌及黑曲霉四種。考慮到在臨床上的檢出率，增加了表皮葡萄球菌[5]，故本試驗(yàn)共五種標(biāo)準(zhǔn)菌株。

4.2 結(jié)果判斷

兩批含苯扎溴銨0.2%（V/V）的利巴韋林滴眼液（批號(hào)：200417，20190124）參照《中國(guó)藥典》[4]，分別人工污染5種標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉，測(cè)試在特定時(shí)間內(nèi)供試品對(duì)相應(yīng)菌株的抑制效力，結(jié)果試驗(yàn)的兩批利巴韋林滴眼液抑菌效力均能達(dá)到《中國(guó)藥典》[4]滴眼劑A級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，符合在有效期內(nèi)長(zhǎng)期儲(chǔ)存的要求，見(jiàn)表5。

表5 滴眼液抑菌效力判斷