基于納米壓痕測試的骨骼力學特性解剖學區域差異研究

張冠軍，顧紅躍，陳萍，李振濤，賈曉航

（湖南大學汽車車身先進設計制造國家重點實驗室，湖南長沙 410082）

骨骼是一種具有層次結構的復合材料，對其力學性能的研究一直廣受關注.皮質骨主要由礦物質（50%-60%）、膠原蛋白（30%-40%）和水（10%-20%）組成，礦物質比較堅硬，而膠原蛋白比較松軟，二者的相互作用決定了骨骼的微觀力學性能［1］.皮質骨的力學性能不僅僅取決于其組成成分，也受微觀結構的影響［2］.皮質骨的微觀結構主要有環骨板、骨單位以及間質骨，大型哺乳動物在生長發育過程還會形成層狀骨［3］.由于這幾種結構在骨骼的分布不均勻，骨骼不同區域的力學性能也不相同.準確地獲取皮質骨的微觀力學性能不僅對理解骨骼的整體力學性能至關重要，而且對建立更加精細的有限元模型以模擬骨骼裂紋損傷也起著相當關鍵的作用.

目前，很多學者探究了骨骼不同解剖學區域的力學性能.Bonney 等［4］采用三點彎曲試驗探究了豬股骨不同解剖學區域的力學性能與成分之間的變化趨勢；Li 等［5］采用三點彎曲試驗探究了牛股骨不同解剖學區域的斷裂韌性；Li 等［6］采用壓縮和拉伸試驗方式分析了牛股骨不同解剖學區域的力學性能變化；Abdel-Wahab等［7］采用拉伸試驗研究了骨骼不同解剖學區域以及不同方向的力學性能；Duchemin等［8］采用拉伸和壓縮試驗探究了骨骼不同解剖區域的密度與彈性模量之間的關系；Espinoza Orías 等［9］采用超聲波測試探究了骨骼的彈性各向異性和不均勻性在不同解剖學區域的變化規律；Malo 等［10］采用聲學顯微鏡探究了骨骼彈性系數在不同解剖學區域的變化.受限于傳統試驗方法對試樣尺寸、形狀等的要求，上述研究難以從微觀層面分析解剖學區域對骨骼力學性能的影響.

微納米壓痕測試方法能夠在微/納米尺度上開展力學測試.Rasoulian 等［11］采用參考點壓痕技術（RPI）探究了骨骼不同解剖學區域力學性能與成分之間的關系.Bosiakov 等［12］采用納米壓痕技術探究了骨骼不同象限的彈性性能和韌性.得益于納米壓痕技術的微觀尺度，上述研究在微觀層面上研究了骨骼不同解剖學區域的力學性能.由于骨骼試樣的生物多樣性，統計分析是研究骨骼解剖學區域力學差異的必要方法，但上述文獻在這方面存在局限性.

針對目前研究存在的不足，本文以牛股骨皮質骨為研究對象，利用納米壓痕試驗方法測試了骨骼不同解剖學區域的力學性能，采用統計方法分析了骨骼力學性能在不同解剖學區域的差異.

1 試樣制備與試驗

1.1 壓痕試樣制備

從本地的屠宰場獲取一根新鮮的牛股骨，牛的年齡為18-24 個月（成年）.首先使用手術刀等工具剔除肌肉組織，進行CT 檢查以排除病變等可能對力學性能有影響的骨骼缺陷.然后使用馬克筆在股骨中段標記切割區域，使用手工鋸按照標記從骨干中段獲取一個厚度為30 mm的骨環，如圖1（a）所示.再用馬克筆在骨環表面按照解剖學區域將骨環劃分為前、后、內、外四個區域，使用手工鋸將骨環分割成四個扇形塊，如圖1（b）所示.隨后使用馬克筆在扇形切片的中部畫出長方體試樣的橫截面（10 mm×5 mm），使用手工鋸切割得到4 個10 mm×5 mm×30 mm 的長方體試樣.最后用粗糙度為320 的碳化硅砂紙（ASC，耕耘，中國）對試樣表面進行打磨，最終尺寸為7 mm×3 mm×15 mm，如圖1（c）所示.在每個試樣的六個面標記其方位（近心端P、遠心端D）和解剖學區域（前側A、后側P、內側M、外側L）.整個切割和打磨過程不停地噴灑濃度為0.9%的生理鹽水，以避免溫度過高對骨骼力學性能產生影響.

為方便試樣打磨以獲得光滑的測試面，通常將骨骼試樣鑲嵌在某種基材中.有文獻表明，環氧樹脂具有高黏度和快速固化的特點，能夠有效避免環氧樹脂滲透到骨骼的孔隙中影響骨骼的納米壓痕試驗結果［13］.因此，本文選取環氧樹脂作為鑲嵌基材.鑲嵌時，需要將環氧樹脂和固化劑按比例混合并攪拌，待混合液清澈后澆注于放置了皮質骨的模具中，在室溫下固化后進行脫模以獲得環氧樹脂包裹的納米壓痕試樣，如圖2所示.

圖2 鑲嵌后的試樣Fig.2 The sample embedded in the epoxy resin

對鑲嵌好的試樣進行打磨拋光以確保試樣的被測試面達到納米壓痕測試的粗糙度要求.分別使用粗糙度為P600、P1200、P1500、P2500、P4000 的碳化硅砂紙（ASC250A，耕耘，中國）依次對試樣表面進行打磨，再使用3 μm、1 μm 和0.25 μm 的拋光絨布（MPF250A，耕耘，中國）配合相同規格的金剛石懸浮液（MDS，耕耘，中國）對試樣進行初拋光，最后采用0.05 μm 的拋光絨布（MPF250A，耕耘，中國）配合相同顆粒大小的氧化鋁懸浮液（OPS，耕耘，中國）進行最終拋光.打磨拋光過程中噴灑0.9%生理鹽水保持試樣水合.拋光完成后對試樣進行超聲波洗滌以去除所有殘留物.清洗完的試樣利用光學顯微鏡（Pri?motech，Zeiss，Germany）觀察其表面形貌以確保試樣加載表面相對平整無劃痕，如圖3所示.

圖3 股骨皮質骨縱向橫切面Fig.3 The longitudinal transverse section of femoral cortical bone

所有試樣制備過程中，非處理的試樣均用0.9%生理鹽水浸潤的紗布包裹后放入試管密封，在-20 ℃環境中冷凍保存.試驗前在室溫（25 ℃）環境下將冷凍試樣浸入0.9%的生理鹽水中解凍水合2 h.

1.2 納米壓痕試驗

使用納米壓痕試驗機（NHT3，Anton Paar，Swit?zerland and Austria）［14-19］對試樣進行測試，如圖4 所示，其載荷分辨率和位移分辨率分別為0.02 μN 和0.01 nm.由于玻氏壓頭具有壓頭端部曲率半徑小、低載荷就能引起材料的塑性變形、接觸區域易于表征、清晰度高等優勢，在骨骼納米壓痕測試中獲得了廣泛應用［2，3，13，19-23］，因此本文采用玻氏壓頭進行加載.由于溫度及濕度對試驗結果有較大影響，典型的測試環境溫度范圍為10～35 ℃，相對濕度范圍為20%～80%［24］，因此本文的測試環境選為室溫（25 ℃），濕度為45%～50%.

圖4 NHT3納米壓痕試驗機Fig.4 Nanoindentation tester NHT3

測試前使用熔融的石英作為參考樣品對機器進行校準［25］.本試驗采用載荷控制方式進行加載，以80 mN/min 的恒定速率加載至最大載荷45 mN，然后保壓10 s以消除蠕變效應，最后以80 mN/min 的恒定速率進行卸載，如圖5 所示.根據骨環厚度和四個解剖學區域，確定每個試樣的中心位置.以中心為基點，沿骨環徑向分別向內、向外確定6 個點，點間距為1 mm；沿骨環切向分別向兩側確定3個點，點間距為0.5 mm.在試驗過程中，如遇到骨骼孔隙，壓痕點在骨環徑向平移0.5 mm.每個試樣測試18 個點，如圖6 所示.4 個試樣共計72 個壓痕點.納米壓痕試驗輸出加載力和壓入深度的時間歷程曲線，處理得到載荷-位移曲線.利用歸一化及再還原方法［26］獲得平均載荷-位移曲線.

圖5 納米壓痕試驗加載曲線Fig.5 The loading curve of nanoindentation test

圖6 壓痕點分布示意圖Fig.6 The schematic view of indentation points distribution

1.3 試驗結果處理

利用試驗輸出的載荷-位移曲線，使用Oliver-Pharr 法［25，27］計算測試點的壓入模量及硬度.該方法假設卸載曲線初始階段為線性區域［24，25，27］，將卸載曲線在最大壓入深度處的斜率作為接觸剛度S，如式（1）所示：

式中：F是載荷，h為壓入深度，B、b和hf為根據卸載曲線采用最小二乘法擬合得到的系數，hm為最大壓入深度.

其次，通過接觸剛度S和接觸面積的投影面積Ac獲得壓入折合模量Er，如式（2）所示：

式中：β是與壓頭形狀相關的常數，玻氏壓頭為1.034［25，27，28］；Ac是接觸面積，與最初到達最大載荷時的壓入深度有關，玻氏壓頭的面積公式為A=.

壓入折合模量Er反映壓頭材料參數以及試樣材料參數的復合模量［13］，通過式（3）計算試樣的壓入模量EIT：

式中：v為骨骼的泊松比，通常取0.3［3，13，29］；vi為玻氏壓頭的泊松比，本研究中為0.07；Ei為玻氏壓頭的壓入模量，本研究中為1 140 GPa.

硬度反映材料抵抗彈塑性變形的能力，可通過最大壓入載荷和接觸面積的投影面積得到，如式（4）所示：

式中：Fm為最大壓入載荷，本文取45 mN.

1.4 統計分析

本文使用SPSS 軟件（IBM Corporation，Somers，NY，USA）對壓入模量和硬度進行統計學分析.利用Shapiro-Wilks 方法進行正態性檢驗（p＞0.05），利用Levene 檢驗進行方差齊性檢驗（p＞0.05）.對符合正態分布且滿足方差齊性的參數進行單因素方差分析（one-way ANOVA），否則使用非參數Kruskal-Wallis檢驗，以判斷解剖學區域是否顯著影響壓入模量和硬度.同時，對壓入模量和硬度進行組間多重比較；符合方差分析條件時使用Tukey方法，符合非參數檢驗條件時使用Bonferroni 法，以研究骨骼在不同解剖學區域上的力學差異.本研究中，顯著性水平取0.05.

2 結果

納米壓痕測試得到的各壓痕點的載荷-位移曲線和各解剖區域的平均載荷-位移曲線分別如圖7和圖8所示.

圖7 納米壓痕測試結果與各區域的平均載荷-深度曲線Fig.7 The average load-depth curve of nanoindentation test results and each anatomical region

圖8 不同解剖學區域的平均載荷-深度曲線對比Fig.8 Comparison of average load-depth curves at different anatomic regions

根據納米壓痕測試曲線，計算出的不同解剖學區域的壓入模量和硬度如表1 所示.分別使用Shapiro-Wilks 正態性檢驗和Levene 方差齊性檢驗分析各解剖學區域的壓入模量和硬度是否符合正態分布及方差齊性，結果表明不同解剖學區域的測試點的壓入模量不滿足正態分布（p＜0.05），硬度不滿足方差齊性（p＜0.05），所以使用非參數Kruskal-Wallis檢驗分析解剖學區域對壓入模量和硬度是否存在顯著影響.Kruskal-Wallis檢驗結果如表2所示，解剖學區域對壓入模量（H=34.177，p＜0.001）和硬度（H=32.985，p＜0.001）均有顯著影響.

表1 牛股骨干皮質骨不同解剖學區域的壓入模量和硬度Tab.1 Indentation modulus and hardness at different anatomical regions of cortical bone of bovine femoral shaft

表2 解剖學區域對壓入模量和硬度的Kruskal-Wallis檢驗結果Tab.2 Kruskal-Wallis test results of anatomical region on indentation modulus and hardness

由于Kruskal-Wallis 檢驗不能給出不同解剖學區域間骨骼的壓入模量和硬度是否存在顯著差異，進一步采用Bonferroni 法進行組間多重比較，如圖9所示.對于壓入模量，外側試樣最小，內側試樣最大；內側和前側試樣分別比外側試樣顯著高31.6%（p＜0.001）和26.8%（p＜0.001）；內側試樣也比后側試樣顯著高15.6%（p=0.006）.對于硬度，前側試樣最大，外側試樣最?。磺皞?、內側、后側試樣分別比外側試樣顯著高46.1%（p＜0.001）、30.2%（p＜0.001）和37.4%（p=0.003）.

圖9 牛股骨皮質骨前、后、內、外四個區域間骨骼材料特性的差異Fig.9 Differences of bone material properties among anterior,posterior,internal and external regions of bovine femoral cortical bone

3 討論

本研究利用牛股骨皮質骨開展了納米壓痕測試，研究了不同解剖學區域對牛股骨皮質骨壓入模量和硬度的影響.與文獻相比，本文測試得到的牛股骨皮質骨的平均壓入模量（19.32±3.12 GPa）與Car?nelli 等［30］、Isaksson 等［31］、Akhtar 等［32］的結果基本吻合，略小于Hengsberger 等［33］的結果（如圖10 所示）.本文測試得到的牛股骨皮質骨的平均硬度（0.57±0.12 GPa）與Akhtar 等［32］的結果基本吻合，略小于Carnelli 等［30］、Isaksson 等［31］的試驗結果.本文試驗結果略小的原因，可能與本研究所用試樣為濕潤水合骨骼有關.有文獻指出，干燥骨骼的壓入模量和硬度比水合骨骼增加20%～30%［34］，這種現象不僅存在于牛骨中，在人類骨骼以及其他動物骨骼中也同樣存在［34-36］.與文獻對比（如表3），本試驗得到的骨骼不同解剖學區域的壓入模量和Li 等（2013）［6］、Abdel-Wahab 等（2011）［7］的結果吻合，略小于Rasoulian 等（2013）［11］的結果，這可能與試樣物種有關，本文采用的是牛股骨，而Rasoulian采用的是人類股骨.

表3 不同文獻中骨骼不同解剖學區域上的彈性模量對比Tab.3 Comparison of material parameters in different anatomical region s of bones in different papers

圖10 不同文獻中牛股骨皮質骨材料參數對比Fig.10 Comparison of cortical bone material parameters of bovine femur in different papers

本文研究發現，骨骼不同解剖學區域的壓入模量之間存在顯著差異，不同解剖學部位的壓入模量由大到小的順序為：內側＞前側＞后側＞外側.這種差異與骨骼各組成成分的含量密切相關.牛股骨皮質骨主要由叢狀骨、骨單位以及間質骨構成，其中叢狀骨的壓入模量最大，骨單位的最?。?］.Li 等（2013）［6］使用光學顯微鏡對牛股骨中間骨干橫截面進行了光學測試，實驗結果表明，牛股骨皮質骨前側和內側中叢狀骨占多數，后側和外側中骨單位占多數.因此，可以推測前側和內側區域的壓入模量大，而后側和外側區域的壓入模量小，這與本文的研究結果（內側顯著大于后側和外側、前側顯著大于外側）吻合.有文獻指出，骨骼壓入模量和硬度之間存在很強的相關性［37］（R2=0.68，p＜0.01）［21，37］.本文的結果也表明，骨骼壓入模量和硬度之間有高度的相關性（R2=0.586，p＜0.01），例如內側的壓入模量顯著大于外側，并且內側的硬度也顯著大于外側；前側的壓入模量顯著大于外側，并且前側的硬度也顯著大于外側.當然，從圖7中也可以看出，本文中骨骼不同解剖學區域的壓入模量和硬度的顯著性差異并不完全一致.原因可能是壓入模量代表了骨骼的彈性能力，而硬度更多的是與骨骼的微觀破壞機制有關，比如膠原-礦物界面的移動［38-40］，這兩者分別代表骨骼不同時期的受力情況.另外，有限的試樣數量也可能是一個影響因素.

4 結論

本文以牛股骨為試驗對象，使用納米壓痕測試方法獲取載荷-深度曲線，使用Oliver-Pharr 法計算了皮質骨試樣的壓入模量和硬度.非參數Kruskal-Wallis分析表明，牛股骨皮質骨不同解剖學區域的壓入模量和硬度存在顯著差異（p＜0.001）.組間多重比較表明，前側試樣的壓入模量和硬度顯著高于外側試樣，內側試樣的壓入模量和硬度顯著高于外側試樣，后側試樣的硬度顯著高于外側試樣，內側試樣的壓入模量顯著高于外側試樣.在建立長骨有限元模型時，有必要采用非均一的材料模擬骨骼的生物力學響應.