姜黃素預處理對缺血-再灌注所致急性腎損傷大鼠腎組織血管內皮修復和內皮祖細胞歸巢的影響▲

倪 琦 林 化

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院1 科研部，2 重癥醫學科，南寧市 530023，電子郵箱：danilaile@sohu.com)

缺血-再灌注是導致急性腎損傷的常見原因，常見于腎臟外科手術、腎移植、腎臟體外沖擊波碎石等。缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)可引起腎小管上皮細胞缺血、壞死，甚至導致急性腎衰竭，其始動因素是毛細血管內皮損傷，因此減輕血管內皮損傷是預防和治療腎臟IRI的關鍵[1]。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPC)作為多能造血干細胞之一，在生理或病理條件下可以從骨髓中動員至外周血，并隨之遷移、歸巢至受損的組織、器官局部，參與損傷血管的修復[2]，目前已被廣泛應用于缺血組織的血運重建[3]。因此，促進EPC向腎臟歸巢可能有利于腎臟毛細血管內皮細胞的修復，從而可改善腎臟的IRI。

姜黃素是從姜黃屬類植物根莖中提取的一種多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抑制動脈粥樣硬化等廣泛的藥理作用[4]。姜黃素還能夠保護或改善血管內皮功能，對內皮功能的恢復有著重要作用[5]。此外有研究表明，姜黃素可以減輕內毒素休克誘發的兔急性腎損傷[6]。姜黃素不僅對腦、卵巢等器官的IRI具有保護作用[7-8]，還能通過提高血清超氧化物歧化酶含量、降低丙二醛含量，來減輕大鼠腎臟的IRI[9]。然而姜黃素能否通過趨化EPC促進血管內皮的修復，從而發揮減輕缺血-再灌注所致急性腎損傷的作用，尚未見有相關研究。本研究通過建立大鼠腎臟IRI模型，探討姜黃素是否可以通過促進EPC歸巢以修復損傷的腎臟毛細血管內皮，從而改善缺血-再灌注導致的急性腎損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑：姜黃素(美國TargetMol公司，批號：T1516)，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)將姜黃素溶解至200 mg/mL；蘇木精染液(珠海貝索生物技術有限公司，批號：BA-4097)；CD31抗體(美國Abcam公司，批號：ab182981)；兔抗大鼠 CD133抗體(美國Abcam公司，批號：ab19898)；小鼠抗大鼠CD34抗體(博奧森生物技術有限公司，批號：bsm-16538M)；辣根過氧化物酶標羊抗兔IgG(美國Jackson ImmunoResearch公司，批號：115-035-003)；Alexa Fluor 594標記羊抗鼠IgG(美國Cell Signaling Technology公司，批號：#8890)；Alexa Fluor 488標記羊抗兔IgG(美國Cell Signaling Technology公司，批號：4412s)；阿利新藍-過碘酸-雪夫染色試劑盒(索萊寶生物技術有限公司，批號：G1285)。

1.1.2 儀器：全自動脫水機(德國徠卡公司，型號：ASP300S)，全自動輪轉石蠟切片機(美國Thermo Scientific公司，型號：HM355S)，展烤片機(天津愛華醫療器械有限公司，型號：ZKPJ-1A型)，恒溫孵育箱(上海一恒科學儀器有限公司，型號：DHP-9052)。

1.1.3 動物與實驗分組：雄性無特定病原體級SD大鼠24只，8～12周齡體重180～220 g，購于廣西醫科大學動物實驗中心[許可證編號:SCXK(桂)2014-0002]。大鼠飼養在室內通風及光線良好、溫度22 ℃、濕度50%的實驗室環境中。將大鼠按照隨機數字表法分為正常對照組、腎臟IRI模型組、陰性對照組、姜黃素干預組，每組6只。姜黃素干預組大鼠于造模前7 d開始腹腔注射姜黃素(200 mg/kg，1次/d)，陰性對照組予1 mL/kg的DMSO腹腔注射，姜黃素干預組和陰性對照組均于第7天給藥1 h后造模，正常對照組及腎臟IRI模型組均不給予DMSO、姜黃素及其他干預。

1.2 方法

1.2.1 建模：各組大鼠均于術前12 h禁食，自由飲水，稱重，10%水合氯醛(3.3 mL/kg)腹腔注射，充分麻醉后仰臥位固定于鼠板上，剪毛備皮、消毒，沿腹中線做4～5 cm的切口,逐層切開。用棉簽充分暴露大鼠左側腎臟，分離腎門周圍的結締組織和脂肪組織，充分暴露腎臟血管，保護輸尿管，用動脈夾夾閉腎動脈，腎臟顏色由鮮紅色變暗紫色，說明缺血模型造模成功。40 min后松開動脈夾，腎臟血流恢復，腎臟在十幾秒內恢復為粉色。往腹腔中滴入無菌生理鹽水，逐層縫合肌肉、皮下組織和皮膚，碘附消毒切口后送回飼養籠，正常進水、進食，24 h后處死各組大鼠，摘取左側腎臟，最大切面剖成兩半，一半固定于10%中性福爾馬林溶液中待檢，另一半于-80℃保存。

1.2.2 阿利新藍-過碘酸-雪夫染色：取出固定于10%中性福爾馬林溶液的腎組織，脫水，石蠟包埋，制作厚度為4 μm的石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水，水洗3 min，阿利新藍染色液染色20 min，蒸餾水洗滌，高碘酸中氧化5 min，自來水沖洗，蒸餾水浸洗，雪夫試劑浸染20 min，流水沖洗，蘇木素復染2 min，蒸餾水水洗，分化液分化2～5 s，蒸餾水水洗，Scott藍化液返藍，水洗，逐級常規乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。分別于每張切片腎皮質區隨機取5個視野(200倍鏡)，計數每個視野下擴張腎小管的數量(取平均值)。

1.2.3 免疫熒光雙染檢測：腎組織石蠟切片經二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，血清封閉，滴加一抗兔抗大鼠CD133抗體(1 ∶100)、小鼠抗大鼠CD34抗體(1 ∶100)，4℃過夜，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗片，滴加Alexa Fluor 594標記羊抗鼠IgG(1 ∶500)和Alexa Flour 488標記的羊抗兔 IgG(1 ∶500)，37℃孵育0.5 h，PBS洗片，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)，PBS洗片，封片。CD133陽性細胞為綠色熒光，CD34陽性細胞為紅色熒光，CD133/CD34雙陽性細胞即為EPC，顯示為黃色熒光。

1.2.4 免疫組化染色：腎組織石蠟切片脫蠟至水，抗原修復、3%過氧化氫封閉，血清封閉，加入CD31抗體(1 ∶2 000)，4℃過夜，PBS洗片后，加入二抗辣根過氧化物酶標羊抗兔IgG(1 ∶300)，37℃孵育0.5 h，洗片后加二氨基聯苯胺顯色3 min，自來水沖洗，逐級常規乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。采用Image-Pro Plus圖像軟件分析免疫組化染色結果，每張切片于200倍鏡的視野下采集10張圖像，細胞胞質可見棕黃色顆粒表達(即為陽性區域)，計算陽性區域的平均光密度值。CD31廣泛表達于腎小管周圍毛細血管內皮細胞中，其光密度值反映CD31蛋白表達量，可以間接反映腎小管周圍毛細血管的密度，光密度值越大，表示腎小管周圍毛細血管的密度越高。

1.3 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 姜黃素對腎臟IRI大鼠腎小管損傷情況的影響 阿利新藍-過碘酸-雪夫染色結果顯示，正常對照組腎組織結構完整，腎小球、腎小管結構正常。與正常對照組相比，腎臟IRI模型組出現較多的擴張腎小管，小管上皮細胞扁平，還有部分腎小管上皮細胞腫脹、壞死，小管結構不清楚，腎間質局部可見炎細胞浸潤，腎小球基底膜略微增厚。陰性對照組腎小管的情況與腎臟IRI模型組相同。與正常對照組相比，姜黃素預處理組也有少量擴張腎小管、上皮細胞腫脹，但擴張腎小管數目較腎臟IRI模型組減少，炎細胞浸潤較少，腎小球基底膜正常。見圖1。

腎臟IRI模型組和陰性對照組的擴張腎小管數量較正常對照組增多(均P<0.05)，陰性對照組與腎臟IRI模型組的擴張腎小管數量差異無統計學意義(P>0.05)；姜黃素干預組的擴張腎小管數量較腎臟IRI模型組和陰性對照組減少(均P<0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠腎臟組織阿利新藍-過碘酸-雪夫染色情況(黑色星狀圖標代表擴張腎小管)

表1 4組大鼠擴張腎小管數量的比較(x±s，個)

2.2 姜黃素對腎臟IRI大鼠腎組織EPC歸巢的影響 腎臟IRI模型組和陰性對照組腎組織EPC數量較正常對照組增多(均P<0.05)；陰性對照組與腎臟IRI模型組腎組織EPC數量差異無統計學意義(P>0.05)，而姜黃素干預組腎組織EPC數量較腎臟IRI模型組和陰性對照組增加(均P<0.05)。見表2、圖2。

表2 4組大鼠腎組織EPC數量的比較(x±s，個)

圖2 各組大鼠腎組織CD133/CD34免疫熒光雙重染色情況

2.3 姜黃素對腎臟IRI大鼠腎組織CD31表達的影響 正常對照組CD31廣泛表達于腎小管周圍毛細血管內皮細胞中，呈黃色顆粒狀分布于細胞質中。腎臟IRI模型組腎小管周圍毛細血管內皮細胞中CD31陽性細胞顯著減少。陰性對照組腎小管周圍毛細血管內皮細胞中CD31陽性細胞表達情況與腎臟IRI模型組相當。姜黃素干預組較腎臟IRI模型組腎小管周圍毛細血管內皮細胞CD31陽性細胞增多。見圖3。

腎臟IRI模型組和陰性對照組腎小管周圍CD31表達較正常對照組減少(均P<0.05)，陰性對照組與腎臟IRI模型組腎小管周圍CD31表達差異無統計學意義(P>0.05)；姜黃素干預組腎小管周圍CD31表達較正常對照組減少，但較腎臟IRI模型組和陰性對照組增多(均P<0.05)。見表3。

圖3 各組大鼠腎組織中CD31的表達情況

表3 4組大鼠腎臟CD31表達的比較(x±s)

3 討 論

腎臟IRI源于血管內皮的損傷，腎間質血管內皮損傷致血管腔狹窄，造成“無復流現象”，使腎小管上皮細胞攝取的氧和營養物質減少，導致其缺血、壞死，修復損傷的血管內皮細胞可預防或減輕腎小管上皮細胞的損傷，因此血管內皮細胞的損傷修復尤為重要[1]。干細胞技術尤其是EPC在組織損傷修復中的應用，受到越來越多的關注。EPC是一種骨髓源性的干細胞，通過動員、趨化、歸巢、增殖和分化等多個過程參與損傷血管內皮細胞的修復[10]。組織缺氧或血管內皮損傷時，EPC被動員到外周血中，經過遷移、歸巢到內皮損傷部位并分化為成熟內皮細胞，參與損傷內皮的修復及新生血管的生成。因此，EPC是血管內皮損傷修復的主要來源，是防治腎臟IRI的重要靶點。有學者發現，EPC可通過促進血管生成、抑制細胞凋亡、降低炎癥水平和纖維化來減輕缺血誘導的急性腎損傷[11]。而組織損傷時EPC從骨髓中釋放出來后能否有效遷移、歸巢至受損部位，是血管再生和損傷修復的關鍵。多種中藥有效單體和中藥復方可以促進EPC的動員，具有促進EPC增殖、遷移、分化及形成血管能力等作用[12]。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術等的根莖中提取的一種植物多酚。曾松柏等[13]的研究表明，姜黃素可以上調冠狀動脈血管內皮生長因子的表達，而血管內皮生長因子參與血管新生過程，不僅可以誘導EPC向成熟內皮細胞分化，促進血管內皮細胞分裂增殖，同時還是EPC的重要趨化因子。

腎小管是腎臟中對缺血性損傷時最敏感的部位。缺血-再灌注后腎小管上皮細胞壞死、萎縮和凋亡，腎小管管腔擴大，并且壞死的腎小管上皮細胞脫落，形成細胞碎片，導致局部間質的炎癥浸潤，因此腎小管擴張是急性腎損傷的重要病理改變。本研究結果顯示，腎臟IRI模型組的擴張腎小管數量較正常對照組增多，而姜黃素干預組的擴張腎小管數量較腎臟IRI模型組減少(P<0.05)，說明姜黃素預處理可以減輕缺血-再灌注誘導的腎小管損傷。

缺血-再灌注過程有可能損傷腎小管周圍的毛細血管內皮細胞，引起腎小管周圍毛細血管破壞，從而導致腎小管上皮細胞供血、供氧不足，影響腎小管正常的組織結構和功能。CD31是血管內皮細胞的特異性標志因子，主要存在于血管內皮細胞中，在腎臟中見于腎小球內皮細胞和腎小管周圍毛細血管內皮細胞，CD31染色可以反映腎臟毛細血管的走行和微血管密度[14]。本研究結果顯示，腎臟IRI模型組腎小管周圍CD31表達量較正常對照組減少，而姜黃素干預組腎小管周圍CD31表達量較腎臟IRI模型組增高(P<0.05)，表明姜黃素預處理可促進腎小管周圍毛細血管內皮細胞的修復。在腎損傷時，EPC歸巢至損傷部位，增殖分化為血管內皮細胞，參與腎小管周圍毛細血管內皮的損傷修復。本研究結果顯示，腎臟IRI模型組腎臟EPC含量較正常對照組增多，而姜黃素干預組腎臟EPC含量較腎臟IRI模型組進一步增多(P<0.05)，提示姜黃素預處理促進EPC歸巢。因此我們推測姜黃素有可能通過促進EPC歸巢，以修復腎小管周圍毛細血管損傷的內皮細胞，從而改善IRI誘導的急性腎損傷。

干細胞治療已經成為腎臟IRI的治療新方向，但目前尚未找到EPC有效的激活劑。姜黃素作為我國的傳統中藥，具有藥物安全濃度范圍大、毒副作用小、價格低廉等特點，可用于治療腎臟IRI，也可以作為EPC有效的激活劑應用于血管再生治療，其有可能成為干細胞治療的輔助性用藥。但姜黃素促進EPC歸巢及血管內皮損傷修復的具體機制及通路仍有待于進一步深入研究。