異氟醚全身麻醉對腰椎間盤突出癥大鼠海馬區小膠質細胞活化及炎癥的影響▲

張 玲 陳 堯 程 超 趙志剛

(湖北省黃石市中醫醫院1 麻醉科，2 骨科，黃石市 435000，電子郵箱:dzyx_13@163.com；3 湖北省武漢市普愛醫院微創脊柱外科，武漢市 430032)

腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)是骨科常見疾病，我國每年新患病人數約為150萬例，近年來隨著我國老齡化加劇其發病率逐年升高[1]。對于保守治療無效的LDH，手術效果確切，是重要的治療手段，但手術具有創傷性，且麻醉可影響患者認知功能，導致術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)發生率高[2]。研究顯示，在非心臟大手術后的出院患者中，老年患者POCD發生率達40%，40歲以下患者POCD發生率也達36%，POCD對患者生活質量造成嚴重影響[3]。研究表明，手術等創傷性操作可導致機體產生免疫應激，免疫應激可引起炎癥反應尤其是中樞神經系統(central nervous system，CNS)的炎癥反應，繼而可引發POCD[4]。另有研究證實，異氟醚麻醉是誘發CNS炎癥反應的重要因素[5]，但具體機制仍不明確。因此，明確異氟醚麻醉誘發CNS炎癥反應的作用機制，對臨床上預防POCD的發生有重要意義。小膠質細胞是CNS中重要的免疫細胞，其活化水平與炎癥反應進展關系密切。本研究采用異氟醚麻醉成年大鼠后建立LDH大鼠模型，誘導CNS炎癥反應，觀察建模后大鼠海馬組織中小膠質細胞活化及炎癥反應情況，探究CNS炎癥反應發病機制，為POCD的預防提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級雄性SD大鼠40只，3月齡，體質量230～270 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2016-0011。大鼠自由飲水進食，飼養于12 h明暗交替、濕度為50%～60%、室溫為22℃～25℃的環境，動物實驗符合減少、替代和優化的原則。

1.2 主要試劑和儀器 異氟醚(山東魯南貝特制藥有限公司，批號：20201305)，兔抗大鼠離子鈣結合銜接分子1(ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba-1；美國Abcam公司，批號：ab10354)，鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex，SABC)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：SA0011)4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、防淬滅封片劑(上海碧云天生物技術研究所，批號：C1002、P0131-5)，兔抗大鼠含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family Pyrin domain containing 3,NLRP3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase1)、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptotic-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)多抗(美國ZenBio公司，批號：30895、35602，BK-K5533)，山羊抗兔熒光二抗(武漢三鷹生物技術有限公司，批號：AMJ-AB2011)，白細胞介素 1β(interleukin，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國R&D公司，批號：HS2098、MTA00B)，二喹啉甲酸蛋白定量分析試劑盒(美國Thermo公司，批號：23227)。曠場實驗、條件恐懼實驗器材(上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XC404)，激光共聚焦顯微鏡、切片機(德國徠卡顯微系統貿易公司，型號：SP8、SM2010R)，化學發光成像分析系統(美國Bio-Rad公司，型號：CheniDoc XRS)。

1.3 分組及建模方法 采用體質量排序隨機分組法將40只大鼠分為對照組10只、模型組30只。參照文獻[6]，采用自體髓核移植法，取模型組大鼠建立LDH模型，將大鼠置于連接小動物麻醉機的透明盒中，調節異氟醚吸入濃度為2.0%，誘導麻醉后取出，將大鼠固定于手術臺上，以2.0%異氟醚通過呼吸面罩維持麻醉。無菌條件下距尾根約4 cm處斷尾，切開尾部椎間盤，取椎間盤髓核組織約4 g，置于無菌生理鹽水中備用，縫合傷口。背部剃毛消毒，沿背正中做4 cm切口，鈍性分離皮膚、筋膜及肌肉，行L5、L6左側椎板和部分上下關節突切除術，暴露馬尾神經及左側L5神經根；將自體髓核組織放置于L5背根神經節硬膜囊交界處，采用4-0腸線環扎L5、L6神經根，以腸線接觸神經根但無明顯壓迫為宜，局部固定牢固，逐層縫合傷口。建模后1～3 d每只大鼠腹腔注射青霉素預防感染。對照組不進行麻醉和手術操作。

1.4 觀察指標

1.4.1 行為學觀察：建模后第1天，采用曠場實驗及條件恐懼實驗觀察大鼠行為學。(1)曠場實驗。將大鼠放入曠場(長×寬×高為100 cm×100 cm×50 cm)底面中心，攝像系統記錄大鼠5 min內在曠場中心區域活動時間。每只大鼠實驗結束后清理糞便并用75%酒精擦拭曠場底部和內壁。(2)條件恐懼實驗。將大鼠置于測試箱中適應3 min，然后給予3.0 kHz、65 dB聲音刺激，時間為30 s，最后2 s同時給予0.7 mA足底電擊，聲音及電刺激結束后，繼續在測試箱中停留2 min后，放回飼養籠。24 h后，再次將大鼠放置測試箱內，不給予刺激，記錄3 min內環境誘發僵直行為。2 h后改變測試箱箱底顏色，再次放入大鼠，給予相同參數聲音刺激3 min，記錄3 min內環境或聲音誘發僵直時間占比，僵直時間占比=僵直時間/3 min×100%。

1.4.2 病理組織標本采集：行為學測試結束后，于建模后2、4、8 d，按照隨機數字表法各選取10只模型組大鼠分批處死，并于實驗開始后2 d將對照組10只大鼠全部處死。按照隨機數字表法，對照組取5只、模型組每批次取5只大鼠，剖開胸腔，剪開右心耳，從左心室快速灌注預熱生理鹽水，至流出灌注液無血色，再緩慢灌注200 mL 4%多聚甲醛固定。斷頭，分離小腦，取雙側海馬組織，將左右側海馬組織分瓶保存于4%多聚甲醛中固定備用。對照組和模型組其余大鼠僅心臟灌注生理鹽水后，快速斷頭后取雙側海馬組織，左右側分開保存于-80℃備用。

1.4.3 小膠質細胞數量檢測：取保存于4%多聚甲醛的左側海馬組織，制備厚度為10 μm的冰凍切片，切片經3% H2O2孵育20 min，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌，0.3% Triton X-100于37℃孵育25 min，牛血清白蛋白封閉30 min，加入一抗兔抗大鼠Iba-1(1 ∶800)，4℃孵育過夜，PBS洗滌，加入SABC試劑盒中生物素標記的山羊抗兔IgG(1 ∶200)，室溫孵育2 h；PBS洗滌后加入SABC孵育1 h，PBS洗滌后進行二氨基聯苯胺顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并計數海馬CA1區Iba-1標記的小膠質細胞數。每張切片取高倍鏡(×400倍)下5個隨機視野計數，5個視野計數之和為每張切片內小膠質細胞總數。

1.4.4 小膠質細胞內NLRP3活化情況檢測：取保存于4%多聚甲醛中的右側海馬組織，制備厚度為8 μm的冰凍切片，PBS洗滌后加入10%山羊血清室溫封閉1.5 h，棄去血清勿洗滌，加入兔抗大鼠NLRP3稀釋抗體(1 ∶50)，4℃孵育過夜，PBS洗滌，加入羅丹明與山羊抗兔熒光二抗(1 ∶100)混合液，避光室溫孵育2.5 h，PBS洗滌，加入DAPI核染6 min；PBS洗滌加入抗熒光淬滅劑，暗室中于激光共聚焦顯微鏡下觀察小膠質細胞內NLRP3活化情況，其中紅色熒光為細胞質內活化的NLRP3，藍色熒光為細胞核。

1.4.5 海馬組織IL-1β、TNF-α水平檢測：取保存于-80℃的左側海馬組織，組織剪剪碎后，勻漿，3 000 r/min離心12 min取上清液，采用ELISA試劑盒檢測IL-1β、TNF-α水平，按照試劑盒說明書要求操作，于全波長酶標儀(美國Thermo Fisher，型號：Multiskan SkyHigh)上測定波長570 nm處吸光度值，根據標準曲線計算待測樣本濃度。

1.4.6 海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表達量檢測：取保存于-80℃的右側海馬組織，加入液氮研磨后加入細胞裂解液于冰上裂解10 min，4℃、12 000 r/min 離心15 min取上清液，進行二喹啉甲酸蛋白定量；取50 μg蛋白樣本與等體積上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min變性，室溫1 2000 r/min離心15 min取上清液，蛋白上樣后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后進行電轉印，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉1 h 后，加入稀釋的一抗(1 ∶500)于4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，10 min/次，加入稀釋的二抗(1 ∶2 000)于室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，暗室中曝光、顯影。于凝膠成像系統掃描拍照，采用灰度值分析軟件分析蛋白條帶的灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參(美國Abcam公司，型號：Ab9485)。以目的蛋白灰度值/內參灰度值表示目的蛋白相對表達情況。

1.5 統計學分析 采用SPSS 19.0統計軟件處理數據。計量資料均以(x±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多樣本比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠的一般情況 造模后，模型組大鼠跛行，術側后爪屈曲、握緊或下垂，休息時出現反復舔舐術側后爪，或輕咬趾甲現象，但均未造成趾甲脫落；除運動功能缺陷外，大鼠還出現煩躁、食量減少、毛發無光澤等現象，隨著建模時間的延長，以上癥狀加重。對照組無上述癥狀，一般情況均正常。提示本研究中模型組大鼠均造模成功。

2.2 兩組大鼠行為學指標的比較 模型組環境誘發僵直時間占比較對照組降低(P<0.05)；兩組中心區域活動時間、聲音誘發僵直時間占比差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠行為學指標的比較(x±s)

2.3 兩組大鼠海馬組織CA1區Iba-1標記的小膠質細胞數量 免疫組化染色結果顯示，對照組、模型組建模后2、4、8 d海馬組織CA1區Iba-1標記的小膠質細胞數量分別為(658.40±15.58)個/視野、(1 033.20±25.06)個/視野、(859.60±22.13)個/視野、(725.40±18.97)個/視野，組間比較差異有統計學意義(F=636.513，P<0.001)。與對照組比較，模型組建模后2、4、8 d小膠質細胞數量均增多(均P<0.05)，但模型組建模后2、4、8 d小膠質細胞數量依次減少 (均P<0.05)。見圖1。

圖1 各組海馬組織CA1區Iba-1標記的小膠質細胞(免疫組化染色，×40)

2.4 兩組大鼠小膠質細胞內NLRP3活化情況 激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，對照組海馬組織細胞質活化NLRP3較少，模型組建模后2 d海馬組織細胞質內NLRP3大量激活，隨著建模時間的延長，細胞質內活化NLRP3逐漸減少，建模后8 d最少。見圖2。

圖2 免疫熒光染色觀察海馬組織小膠質細胞內NLRP3(激光共聚焦顯微鏡，×400)

2.5 兩組海馬組織IL-1β、TNF-α水平的比較 與對照組比較，模型組建模后2 d海馬組織IL-1β、TNF-α水平及建模后4 d TNF-α水平升高(均P<0.05)；與模型組建模后2 d比較，建模后4 d、8 d海馬組織IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05)，但建模后4 d與8 d比較，海馬組織IL-1β、TNF-α水平無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2 兩組海馬組織IL-1β、TNF-α水平的比較(x±s)

2.6 兩組大鼠海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表達情況的比較 與對照組比較，模型組建模后2、4、8 d海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白相對表達量均升高(均P<0.05)；隨建模時間的延長，模型組海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白相對表達量逐漸降低(均P<0.05)。見圖3和表3。

圖3 兩組大鼠海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表達情況

表3 兩組大鼠海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表達相對表達量的比較(x±s)

3 討 論

隨著醫療技術的進步，全球手術量劇增，但術后并發癥也急劇增多，其中POCD是多種手術術后常見的并發癥，而腹部手術、骨科手術術后POCD發病率明顯高于其他類型的手術[7]。研究顯示，患者年齡、基礎疾病、受教育水平及麻醉用藥與POCD的發病密切相關[8]。但POCD發病機制十分復雜，目前尚未完全闡明，而CNS炎癥反應學說已得到研究學者廣泛認可。海馬是CNS中與學習、認知關系密切的重要腦區[9]，了解海馬區炎癥反應對探討CNS功能障礙的發生機制有重要意義。異氟醚是臨床常用的麻醉藥物，但有研究顯示異氟醚麻醉是誘發CNS炎癥反應的重要因素[5]。本研究采用異氟醚麻醉成年大鼠后建立LDH大鼠模型，觀察建模后小膠質細胞活化及炎癥反應的情況，探討CNS炎癥反應的發生機制。

Zhu等[10]應用異氟醚吸入麻醉建立POCD小鼠模型，結果顯示外周免疫細胞可透過血腦屏障引起海馬區炎癥反應，加重異氟醚所致的POCD。Wang等[11]采用1.5%異氟醚麻醉小鼠，1周后對其進行水迷宮實驗，發現小鼠出現POCD，且海馬組織IL-1β、IL-18炎癥因子水平升高。上述研究均提示異氟醚麻醉可導致CNS功能障礙及海馬組織炎癥反應。本研究的曠場實驗結果顯示，兩組大鼠中心區域活動時間差異無統計學意義(P>0.05)，說明異氟醚麻醉對LDH大鼠的機體運動功能無明顯傷害；條件恐懼實驗結果顯示，模型組環境誘發僵直時間占比低于對照組(P<0.05)，但兩組聲音誘發僵直時間占比差異無統計學意義(P>0.05)，說明異氟醚麻醉可造成LDH大鼠海馬依賴性記憶(環境誘發僵直)受損，而對非海馬依賴性記憶(聲音誘發僵直)無明顯影響。而本研究模型組建模后2 d海馬組織IL-1β、TNF-α水平升高，與既往研究結果[12]相符；建模后4 d、8 d海馬組織IL-1β、TNF-α水平低于建模后2 d，說明異氟醚對LDH大鼠造成的海馬組織炎癥有自行減輕的趨勢。

小膠質細胞是固有免疫系統的重要防線，正常生理情況下處于靜息狀態，當CNS處于應激狀態時小膠質細胞迅速活化，并持續釋放炎癥介質(如IL-1β、TNF-α)，參與氧化應激反應，導致CNS功能受損，造成腦認知功能受損[13]。Karpenko等[14]發現，帕金森病患者腦脊液中IL-1β、TNF-α水平顯著升高，且與病程、認知功能受損程度關系密切。NLRP3主要存在于小膠質細胞胞質，由病原菌、應激等刺激信號激活，通過募集接頭蛋白ASC，激活下游Caspase1，進而將前體IL-1β加工為成熟IL-1β，參與調控炎癥反應[15-16]。Li等[17]敲除雄性C57BL/6小鼠的NLRP3基因后，發現小鼠對空氣污染顆粒誘導的神經毒性及炎癥反應減輕，海馬依賴性學習記憶損害得以改善。上述研究均說明小膠質細胞內NLRP3活化在CNS炎癥反應中發揮重要作用。本研究結果顯示，模型組建模后2、4、8 d小膠質細胞數量增多，NLRP3活化水平升高，且海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白相對表達量均升高，但隨建模時間的延長小膠質細胞數量、NLRP3活化水平及NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表達均逐漸降低(P<0.05)。提示異氟醚全麻可能通過促進LDH大鼠海馬區小膠質細胞質中NLRP3活化以上調IL-1β、TNF-α表達，從而引發LDH大鼠的CNS炎癥反應，進一步提示抑制小膠質細胞NLRP3活化對防治POCD具有潛在價值。

綜上所述，應用異氟醚進行全身麻醉可能通過促進LDH大鼠海馬區小膠質細胞質中NLRP3的活化從而誘導IL-1β、TNF-α表達上調，導致CNS炎癥反應的發生。