血清微小RNA-150表達水平與晚期非小細胞肺癌患者行表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑治療效果及預后的關系▲

關 英 郭麗云 王千千 阿選德

(1 青海省西寧市第一人民醫院呼吸內科，西寧市 810000，電子郵箱：gy55255@163.com；甘肅省腫瘤醫院2 放療科，3 腫瘤內科，蘭州市 730000)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有類型肺癌的85%以上，其起病隱匿，早期無明顯癥狀，故患者確診時多為臨床晚期，錯失手術治療時機[1]。近年來，分子靶向藥物表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)被廣泛應用于晚期NSCLC患者的治療中，其可有效地改善患者生活質量，延長患者生存時間[2]。目前，臨床上多通過復查MRI或CT評估NSCLC患者的治療效果，同時一些常見的血清腫瘤標志物也可作為評估NSCLC患者療效的輔助指標[3-4]。研究顯示，微小RNA(microRNA，miRNA)-150在NSCLC患者血清中呈高表達，其可能通過靶向結合SRC激酶信號抑制劑1基因從而促進NSCLC細胞的增殖及遷移，被認為是診治NSCLC的潛在靶標[5]。但血清miRNA-150水平與晚期NSCLC患者行EGFR-TKI治療的效果、預后之間關系的相關研究鮮少?；诖?，本研究探討血清miRNA-150水平與NSCLC患者行EGFR-TKI治療效果及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月至2017年12月西寧市第一人民醫院收治的172例晚期NSCLC患者為研究對象。其中男性82例、女性90例，患者年齡46～85(66.54±10.39)歲；有吸煙史者102例，無吸煙史者70例；腺癌134例，非腺癌38例。納入標準：(1)均符合NSCLC診斷標準[6]，均經細胞學、組織學病理學明確診斷；(2)均為原發腫瘤-區域淋巴結-遠處轉移分期Ⅲ～Ⅳ期；(3)均對本研究所用藥物無禁忌證；(4)臨床檢查資料完整；(5)患者及其家屬均對本研究知情同意，自愿參與本研究。排除標準：(1)合并嚴重心血管系統疾病者；(2)合并其他惡性腫瘤、嚴重肝腎功能障礙者；(3)失訪者；(4)病理診斷不明確者。本研究符合倫理學有關規定，獲得西寧市第一人民醫院醫學倫理委員會審核、批準后實施。

1.2 主要試劑與儀器 TRIzol Reagent(批號：J44580)購買于上海金穗生物科技有限公司，TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit(批號：4366597)購買于上海北諾生物科技有限公司，TaqMan? MicroRNA Assay(批號：MTTXXXXX-ZTD)購買于北京百奧萊博科技有限公司。超微量分光光度計(型號：OSE-260)購買于天根生化科技(北京)有限公司，實時熒光定量PCR儀(型號：4351104)購買于北京智杰方遠科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 治療及隨訪方法：NSCLC患者均口服EGFR-TKI吉非替尼(英國阿斯利康公司，國藥準字J20100014)1片/d(2周為1個療程)，直到難以耐受或腫瘤進展[7]，同時給予常規局部放療。具體放療方案：選取6MV-X線，4野照射進行放療，5次/周照射，2～3 Gy/次，共四周。患者每月進行頭部、胸部CT、MRI-腹部B超和全身骨SPECT/CT掃描檢查，評估轉移灶范圍及大小。對172例NSCLC患者進行長期隨訪，隨訪時間從接受EGFR-TKI治療開始，截至2019年12月30日，或至患者死亡。

1.3.2 療效評價：2個療程結束后評價NSCLC患者服用吉非替尼的療效，以頭部、胸部CT、MRI、胸腹部B超掃描和全身骨SPECT/CT掃描為依據，按照RECIST 1.1版實體瘤療效評價標準[7]進行療效判定。其中，完全緩解指治療后所有腫瘤病灶均消失，并維持1個月以上；部分緩解指治療后腫瘤病灶最大直徑總和較前縮小>30%，并維持1個月以上；疾病穩定指治療后腫瘤病灶直徑略有縮小，但未達部分緩解水準，或腫瘤病灶最大直徑有所增加，但未超過20%；疾病進展指治療后腫瘤病灶最大直徑總和較前增加超過20%，或出現新病灶。治療總有效率=(完全緩解例數+部分緩解例數)/總例數×100%。根據治療效果將NSCLC患者分為有效組、無效組，將完全緩解、部分緩解患者納入有效組，將疾病穩定、疾病進展患者納入無效組。

1.3.3 血清樣本采集：在治療前和接受2個療程后，收集所有患者清晨空腹肘靜脈血3～4 mL，靜置25～30 min，3 800 r/min離心8 min，獲得血清，分裝密封保存于-80℃冰箱中備用待檢。

1.3.4 實時熒光定量PCR法檢測血清miRNA-150相對表達水平：解凍凍存血清樣本，利用TRIzol Reagent試劑提取樣本總RNA。參照TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit說明書將DNA反轉錄為cDNA。以適量cDNA為模板，參考TaqMan? MicroRNA Assay說明書配制反應體系，進行PCR擴增反應。反應體系包括cDNA 2 μL，2×Taqman? Universal Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，無核酸酶水6 μL，總體積為20 μL。以U6為內參基因。miRNA-150上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA -3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；U6上游引物序列為5′- CTCGCTTCGGCAGCACA -3′，下游引物序列為5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT -3′。每個樣本設置3個復孔，以2-ΔΔCt法計算miRNA-150相對表達水平。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗；計數資料以例數和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier曲線法繪制生存曲線，并采用log-rank檢驗分析生存曲線間的差異；采用Cox回歸模型分析NSCLC患者預后的影響因素。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EGFR-TKI治療效果及不同療效NSCLC患者血清miRNA-150相對表達水平的比較 經EGFR-TKI治療后，172例NSCLC患者血清中治療有效46例，治療無效126例，有效率為26.74%(46/172)。治療前，172例NSCLC患者血清miRNA-150相對表達水平為(1.76±0.67)，有效組、無效組患者血清miRNA-150相對表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；治療后，有效組血清miRNA-150相對表達水平低于治療前和無效組(均P<0.05)，無效組血清miRNA-150相對表達水平高于治療前(P<0.05)。見表1。

表1 不同療效NSCLC患者血清miRNA-150相對表達水平的比較(x±s)

2.2 不同臨床特征NSCLC患者的EGFR-TKI療效比較 與有吸煙史者相比，無吸煙史的NSCLC患者的EGFR-TKI治療有效率更高(P<0.05)；治療前血清miRNA-150相對表達水平<1.76的NSCLC患者治療有效率更高(P<0.05)；NSCLC患者的年齡、性別、組織學類型與EGFR-TKI治療效果無關(均P>0.05)。見表2。

表2 不同臨床特征NSCLC患者的EGFR-TKI療效比較[n(%)]

2.3 治療前血清miRNA-150相對表達水平與NSCLC患者預后的關系 對172例NSCLC患者進行隨訪0～24個月，死亡117例，存活率為31.98%(55/172)。Kaplan-Meier生存分析顯示，治療前血清miRNA-150相對表達水平<1.76者的平均生存期為21.02個月，miRNA-150相對表達水平≥1.76者的平均生存期為16.75個月，miRNA-150相對表達水平<1.76者的累積生存率高于miRNA-150相對表達水平≥1.76者(χ2=34.707，P<0.001)見圖1。

2.4 NSCLC患者行EGFR-TKI治療后生存情況的影響因素 以NSCLC患者年齡(<65歲=0，≥65歲=1)、性別(女=0，男=1)、吸煙史(無=0，有=1)、組織學類型(腺癌=0，非腺癌=1)、治療前血清miRNA-150相對表達水平(<1.76=0，≥1.76=1)為自變量，以NSCLC患者預后為因變量(生存=0，死亡=1)，進行多因素Cox回歸分析，結果顯示，組織學類型、血清miRNA-150相對表達水平是NSCLC患者服用EGFR-TKI吉非替尼后生存情況的獨立影響因素(均P<0.05)。見表3。

圖1 治療前血清miRNA-150相對表達水平與NSCLC患者預后的關系

表3 NSCLC患者行EGFR-TKI治療后生存情況影響因素的Cox回歸分析

3 討 論

NSCLC是最常見的肺癌類型，其發病率及病死率極高，預后較差，嚴重影響患者生存質量[8]。化療是治療晚期NSCLC患者的主要手段，但化療效果欠佳及藥物的毒副作用限制其臨床應用范圍。研究顯示，EGFR-TKI靶向治療已成為治療表皮生長因子受體基因敏感突變的晚期NSCLC患者的首選方案[9]。本研究結果顯示，EGFR-TKI治療NSCLC患者的有效率為26.74%，與高原等[10]的研究結果相似，提示EGFR-TKI治療晚期NSCLC具有一定臨床療效。

臨床上多采用影像學手段評價NSCLC患者的治療效果，但影像學檢查費用昂貴，具有輻射副作用，不適合短時間重復檢查，存在一定局限性。而血清標志物對惡性腫瘤的治療效果有一定評估價值，且血清學指標具有取樣方便、檢測快速、重復性好等特點。miRNA廣泛分布于外周血及各器官組織中，其可調控細胞增殖、凋亡、免疫調節、信號傳導、炎癥反應等生物學過程，在直腸癌、肝癌、胰腺癌、NSCLC等多種腫瘤的發生和發展過程中發揮重要調節作用[11-13]。研究顯示，miRNA-150-5p是miRNA-150家族成員之一，其在NSCLC中表達失調，可通過靶向調節高遷移率族蛋白A2等的表達水平，影響NSCLC細胞的轉移及復發[14]。另有研究顯示，miRNA-150在NSCLC中表達上調，其可通過靶向負調控叉頭樣轉錄因子O4，進而影響上皮-間充質轉化，促進NSCLC細胞轉移，此外，而敲除叉頭樣轉錄因子O4表現出和miRNA-150過表達類似的分子效應，由此可見miRNA-150可能通過調控相關信號通路，在上皮-間充質轉化過程中起到促進作用[15]。徐建林等[16]發現，miRNA-150在NSCLC患者腫瘤組織中過表達，miRNA-150高水平者預后較差，認為其有望成為診斷NSCLC及預后監測的分子標志物。以上研究表明，異常表達的miRNA-150與NSCLC的發生和發展進程關系密切。本研究結果顯示，EGFR-TKI治療后，有效組血清miRNA-150相對表達水平低于治療前和無效組(P<0.05)，無效組血清miRNA-150相對表達水平高于治療前(P<0.05)，提示miRNA-150可能在NSCLC的發展過程中發揮重要作用，且治療前血清miRNA-150水平與晚期NSCLC患者EGFR-TKI治療效果有關。推測可能原因為miRNA-150作為miRNA家族一員，其可能通過與靶基因結合影響信號傳導，進而影響NSCLC細胞的增殖、凋亡、轉移及侵襲等生物學過程，從而影響NSCLC的發展進程；如吉非替尼等EGFR-TKI可通過與三磷酸腺苷競爭酪氨酸激酶位點，進而抑制胞內酪氨酸激酶的磷酸化，抑制表皮生長因子受體信號傳導，抑制癌細胞增殖、生長及血管生成等，從而在進展性及復發性NSCLC中發揮抗腫瘤作用[17]。由此，miRNA-150可能是吉非替尼等EGFR-TKI的作用靶點，NSCLC患者經EGFR-TKI治療后，miRNA-150水平發生變化，提示miRNA-150水平變化能反映EGFR-TKI的治療效果。此外，經EGFR-TKI治療后，有效組NSCLC患者病灶顯著縮小，惡性腫瘤生長及轉移受抑制，血清miRNA-150相對表達水平可能受影響。

本研究結果顯示，無吸煙史、治療前血清miRNA-150相對表達水平<1.76的患者行吉非替尼治療的效果更好。治療前血清miRNA-150相對表達水平<1.76的NSCLC患者經吉非替尼治療后的生存率高于治療前血清miRNA-150相對表達量≥1.76的患者(P<0.05)；進一步行多因素Cox回歸分析，發現組織學類型、治療前血清miRNA-150相對表達水平是影響NSCLC患者服用EGFR-TKI吉非替尼后生存情況的獨立影響因素(P<0.05)。這提示治療前血清miRNA-150表達水平異常均可能會影響NSCLC患者行EGFR-TKI治療后的預后情況，動態監測血清miRNA-150水平，有利于評估患者預后狀況。

綜上所述，治療前血清miRNA-150表達水平低與晚期NSCLC患者行EGFR-TKI治療的效果及預后較好密切相關，監測血清miRNA-150水平或有助于評估NSCLC患者預后。但本研究樣本量較少，實驗結果可能出現偏差，后續將增加樣本量進行深入探究。