縮氨基硫脲衍生物的合成及抗菌活性研究

劉海彬, 呂 萍

(遼寧科技學院 生物醫(yī)藥與化學工程學院,遼寧 本溪 117004)

縮氨基硫脲及其衍生物由于具有廣泛的生物活性如抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗結(jié)核、抗瘧等而備受人們的重視[1-5]。在縮氨基硫脲化合物中,-N1NHC(S)N4-結(jié)構(gòu)是縮氨基硫脲化合物具有生物活性的基本活性單元,N(1)上醛酮的不同結(jié)構(gòu)及N(4)上不同結(jié)構(gòu)的活性基團,對其抗菌、抗腫瘤等多種生物活性的強弱將產(chǎn)生極大影響[6-10]。水楊醛及其衍生物是有機合成和精細化工重要的中間體,廣泛用于農(nóng)藥、醫(yī)藥、香料、螯合劑、染料中間體等領(lǐng)域[11-12]。

因此,本文根據(jù)生物活性拼合原理,把水楊醛結(jié)構(gòu)引入到縮氨基硫脲化合物中,以期得到具有更強抗菌活性的化合物,合成了一系列含有水楊醛結(jié)構(gòu)的縮氨基硫脲(Scheme 1),并且對它們進行了抗菌活性研究。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WRS-1B型數(shù)字熔點儀(溫度計未校正)；Bruker avance 500 Hz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標)；Thermo LCQ Fleet HPLC-MS型質(zhì)譜儀；WQF-510型紅外光譜儀；ZF-I型三用紫外分析儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 乙酸鈉(1)的合成

在室溫下,將氯乙酸28.4 g(0.3 mol)溶于盡量少的乙醇中并置于冰水浴中冷卻,不斷攪拌下將冷卻至5 ℃左右的0.3 mol氫氧化鈉飽和水溶液逐滴加到上述氯乙酸的乙醇溶液中,使反應(yīng)液溫度不超過10 ℃,滴加完畢后,放置5 min,抽濾,無水乙醇洗滌,真空干燥,得氯乙酸鈉白色結(jié)晶134.64 g,產(chǎn)率90%。

(2)N(4)取代氨基硫脲(2)的合成

N(4)鄰甲苯基氨基硫脲的合成：參照文獻[13]方法,向鄰甲苯胺10.7 g(0.1 mol)和乙醇(95%)30 mL中加入20 mL濃氨水,不斷攪拌下15 min內(nèi)緩慢滴加CS28.0 mL,并控制溫度在30 ℃以下。反應(yīng)液澄清后,室溫靜置1 h,加入氯乙酸鈉11.6 g(0.1 mol),室溫下攪拌至反應(yīng)液再次澄清,后加入水合肼(80%)12 mL反應(yīng)1 h。將反應(yīng)液濃縮至原體積的1/2,析晶,抽濾,粗產(chǎn)品在乙醇和少量水中重結(jié)晶,得到N(4)-鄰甲苯基氨基硫脲11.7 g,產(chǎn)率70.4%, m.p.147.6～149.1 ℃(147～148 ℃[13])；1H NMR(CDCl3, 500 MHz)δ: 9.40(s, 1H, NH), 9.09(s, 1H, NH), 7.54(d,J=5.9 Hz, 1H, ArH), 7.21(d,J=7.4 Hz, 1H, ArH), 7.15(t,J=7.3 Hz, ArH), 7.12(t,J=7.2 Hz, 1H, ArH), 4.45(s, 2H, NH2), 2.21(s, 3H, CH3)。

N(4)苯基氨基硫脲的合成：合成方法同N(4)鄰甲苯基氨基硫脲,m.p.135.7～137.9 ℃(140～141 ℃[13])；1H NMR(CDCl3, 500 MHz)δ: 9.69(s, 1H, NH), 9.13(s, 1H, NH), 7.39(d,J=5.4 Hz, 2H, ArH), 7.08(d,J=6.9 Hz, 2H, ArH), 6.61(t,J=7.1 Hz, 1H, ArH), 4.79(s, 2H, NH2)。

N(4)羥乙基氨基硫脲的合成：合成方法同N(4)鄰甲苯基氨基硫脲,m.p.114.8～116.6 ℃；1H NMR(CDCl3, 500 MHz)δ: 9.40(s, 1H, NH), 9.08(s, 1H, NH), 4.43(s, 2H, NH2), 3.83(t,J=5.5 Hz, 2H, CH2), 3.77(t,J=3.5 Hz, 2H, CH2)。

(3) 化合物3的合成通法

向帶有冷凝裝置的100 mL燒瓶中加入溶有0.01 mol取代水楊醛的15 mL無水乙醇溶液和溶有0.01 molN(4)-取代氨基硫脲的無水乙醇(15 mL)溶液,并加入兩滴濃硫酸,回流反應(yīng)4 h。冷卻至室溫,抽濾,乙醇中重結(jié)晶得產(chǎn)物。

水楊醛N(4)鄰甲苯基縮氨基硫脲(3a)： 白色晶體,產(chǎn)率68.2%, m.p.172.8～173.4 ℃;1H NMR(CDCl3, 500 MHz)δ: 10.33(bs, 1H), 9.45(bs, 1H), 8.18(s, 1H), 8.14(s, 1H), 7.61(d,J=7.5 Hz, 1H), 7.35(t,J=8.5 Hz, 1H), 7.31～7.28(m, 4H), 6.99(d,J=8.5 Hz, 1H), 6.95(t,J=8.5 Hz, 1H), 2.35(s, 3H, CH3); ESI-MSm/z: 286.10{[M+H]+}。

3,5-二叔丁基水楊醛N(4)鄰甲苯基縮氨基硫脲(3b)： 白色晶體,產(chǎn)率43.1%, m.p.190.4～190.6 ℃;1H NMR(CDCl3, 500 MHz)δ: 10.49(bs, 1H), 9.96(bs, 1H), 8.18(d,J=12.0 Hz, 2H), 7.64(d,J=7.0 Hz, 1H), 7.41(s, 1H), 7.31～7.27(m, 3H), 7.06(d,J=2.0 Hz, 1H), 2.37(s, 3H, CH3), 1.43(s, 9H, C(CH3)3), 1.31(s, 9H, C(CH3)3)； ESI-MSm/z: 398.12{[M+H]+}。

3,5-二溴水楊醛N(4)-鄰甲苯基縮氨基硫脲(3c)： 淡黃色晶體,產(chǎn)率82%, m.p.208.5～208.9 ℃;1H NMR(CDCl3, 500 MHz)δ: 9.33(bs, 1H), 9.29(s, 1H), 8.89(s, 1H), 8.57～8.55(m, 2H), 7.73～7.69(m, 2H), 7.44～7.40(m, 2H), 7.28(d,J=8.5 Hz, 1H), 2.46(s, 3H, CH3)； ESI-MSm/z: 443.52{[M+H]+}。

3,5-二溴水楊醛N(4)-羥乙基縮氨基硫脲(3d)： 白色固體,產(chǎn)率89.3%, m.p.211.8～212.8 ℃；1H NMR(500 MHz)δ: 10.63(bs, 1H), 8.37(s, 1H), 8.20(s, 1H), 7.72(s, 2H), 3.83(t,J=5.5 Hz, 2H), 3.79～3.77(m, t,J=5.0 Hz, 2H)； ESI-MSm/z: 396.12{[M+H]+}。

2-乙酰基吡啶N(4)鄰甲苯基縮氨基硫脲(3e)： 淡黃色固體,產(chǎn)率67.2%, m.p.168.7～170.2 ℃(164～166 ℃[14])；1H NMR(CDCl3, 500 MHz)δ: 9.16(s, 1H), 8.88(s, 1H), 8.63(d,J=4 Hz, 1H), 7.99(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.75(d,J=4.0 Hz, 1H), 7.72(t,J=7.5 Hz, 1H), 7.32～7.22(m, 4H), 2.49(s, 3H), 2.37(s, 3H)。

2-乙酰基吡啶N(4)苯基縮氨基硫脲(3f)：淡黃色針狀固體,產(chǎn)率59.5%, m.p.183.1～184.7 ℃(182～183 ℃[14])；1H NMR(CDCl3, 500MHz)δ: 9.37(s, 1H), 8.83(s, 1H), 8.64(d,J=4.5 Hz, 1H), 8.01(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.76～7.69(m, 5H), 7.32(t,J=6.5 Hz, 1H), 7.26(t,J=7.0 Hz, 1H), 2.48(s, 3H)。

1.3 抑菌活性測試

抑菌活性試驗采用濾紙片法。以金黃色葡萄球菌(S.Aureus,革蘭氏陽性菌)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis,革蘭氏陽性菌)和大腸桿菌(E.Coli,革蘭氏陰性菌)為試驗菌株。用無菌操作分別將細菌(金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌)活化。取活化好的細菌接入9 mL無菌生理鹽水中,充分分散菌體。采用10倍系列稀釋法,制備10倍系列稀釋菌懸液。各梯度菌懸液進行涂布記數(shù),每次用移液管吸取0.2 mL該梯度菌懸液于倒好平板的牛肉膏培養(yǎng)皿中,采用畫半圓法使菌液分布均勻,涂布完成后正置15 min,將平板翻轉(zhuǎn),37 ℃下培養(yǎng)24 h,選取細菌濃度范圍在108CFU/mL的試管做菌懸液。用無菌的移液管吸取1.0 mL菌懸液置于無菌的平板中央,加入約15～20 mL無菌的瓊脂培養(yǎng)基(牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂,約50～60 ℃),輕輕搖勻。以DMSO為溶劑,將化合物分別配成0.1 mg/mL、 0.5 mg/mL和1.0 mg/mL的溶液,分別稱取適量的待測藥品于20 mL燒杯中。將足夠數(shù)量的濾紙片(直徑為6mm)浸泡于溶液中,充分浸泡2 h備用(同時做DMSO溶液空白對照)。待培養(yǎng)基冷卻凝固后,將無菌濾紙片(直徑6 mm)浸于待測試樣分別置于含菌的平板培。待活化完畢后,取出培養(yǎng)基,觀察抑菌結(jié)果,量取抑菌圈直徑,記錄平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 N(4)取代氨基硫脲(2)的合成

脂肪胺或芳香胺與二硫化碳反應(yīng),在濃氨水的存在下,實際上先生成R1-NH-C(S)-SNH4。此步是放熱反應(yīng),需要控制反應(yīng)溫度在30 ℃以下。滴加CS2時需要注意滴加速度,速度不能太快,否則溫度升高會使副產(chǎn)物增多。加入氯乙酸鈉后生成了R1-NH-C(S)-CH2COONa,實際上是氯乙酸鈉作為親核試劑發(fā)生了親核取代反應(yīng)。隨后,水合肼作為親核試劑進行了反應(yīng),為了反應(yīng)進行完全,水合肼是過量的。反應(yīng)結(jié)束后,粗產(chǎn)品經(jīng)重結(jié)晶可得純品。

2.2 化合物3d的表征

化合物3d的氫結(jié)構(gòu)示意圖和1H NMR譜圖如圖1和圖2所示。δ2.053為CD3C(O)CD3的溶劑峰。在化學位移δ10.636～7.719共5個氫,分別是1號、2號、3號、4號和5號氫。水楊醛上羥基氫(3號)與亞胺-CH=N(5號)中的氮形成氫鍵、與N-NH-C(S)-中的氫形成氫鍵,由于受吸電子效應(yīng)影響,降低了電子云密度,使兩種氫表現(xiàn)出較強的去屏蔽效應(yīng),因而其吸收峰出現(xiàn)在低場。化學位移δ3.807～3.769處的吸收峰為兩個亞甲基(7號和8號氫),兩種氫各裂分成三重峰。6號和9號氫為活潑氫,在1H NMR上未顯示出峰。從1H NMR測試結(jié)果推斷,其質(zhì)子在苯環(huán)及其他位置上的結(jié)構(gòu)與目標產(chǎn)物結(jié)構(gòu)一致。

圖1 化合物3d的氫結(jié)構(gòu)示意圖

δ

2.3 抑菌活性

采用濾紙片擴散法測定水楊醛縮氨基硫脲化合物3在不同濃度下抑菌圈直徑,結(jié)果如表1所示。有代表性的化合物3d抑制金黃色葡萄球菌的實驗照片如圖3所示。

表1 化合物3在不同濃度下的抑菌圈直徑(mm)a

圖3 化合物3d在1.0 mg/mL時抑制金黃色葡萄球菌的實驗照片

從表1中可以看出,化合物3a、3b和空白樣DMSO對三種菌株均無抑制活性。化合物3c和3d對3種菌株均有抑制活性；化合物3e和3f對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抑制活性。化合物3d對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有良好的抑菌性,并且隨著溶液質(zhì)量濃度的增大抑菌效果增強。當溶液質(zhì)量濃度達到0.1 mg/mL時,對兩種菌株均為低度敏感,抑菌圈為8 mm；當溶液質(zhì)量濃度達到0.5 mg/mL時,對兩種菌株均為中度敏感,抑菌圈分別為12 mm(金黃色葡萄球菌)和13 mm(枯草芽孢桿菌)；當溶液質(zhì)量濃度達到1 mg/mL時,對兩種菌株均為極度敏感,抑菌圈平均直徑約為30 mm。而化合物3d對大腸桿菌有低度敏感水平。當溶液質(zhì)量濃度達到1 mg/mL時,化合物3e對金黃色葡萄球菌的抑菌圈為23 mm,對枯草芽孢桿菌的抑菌圈為14 mm。從圖3也可以看出,滴加DMSO的濾紙片上顯示為無抑菌圈,而另外3個加有1.0 mg/mL3d溶液的濾紙片周圍顯示出明顯的抑菌圈,抑菌圈平均直徑約為30 mm,證明3d在1.0 mg/mL濃度下對金黃色葡萄球菌有很強的抑制活性。

通過初步的構(gòu)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)：(1)取代水楊醛N(4)縮氨基硫脲的水楊醛部分連有溴原子可以增強革蘭氏陽性菌的抑制活性；(2)2-乙酰基吡啶N(4)縮氨基硫脲可以增強革蘭氏陽性菌的抑制活性；(3)縮氨基硫脲的氨基硫脲部分連有羥基可以增強抑菌活性。

合成了6個縮氨基硫脲化合物3a～3f。體外抗菌活性篩選結(jié)果表明,化合物3d具有良好的抗菌活性,在水楊醛上含有溴、氨基硫脲部分含有羥基對革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌和枯草桿菌)有非常強的抗菌活性,對革蘭陰性菌(大腸桿菌)有一定的抗菌活性。該化合物有可能成為抗革蘭陽性菌的先導化合物,值得進一步研究。