高同型半胱氨酸血癥相關的MTHFR C677T的遺傳多態性與缺血性腦卒中的關系

崔曉蝶 林 平 黃玉冰 白 鷹△

1）大連大學附屬新華醫院，遼寧大連 116621 2）大連大學，遼寧大連 116022

腦卒中是目前全世界面臨的醫學難題。據流行病學研究報道，每年新增腦卒中病例高達250萬，腦卒中相關病因超過100萬，腦卒中分為缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，占所有腦卒中事件的80%以上［1-3］。雖然缺血性腦卒中已被全球關注和研究多年，但缺血性腦卒中具體的病因并不清楚，目前認為其致病因素并不是單一的，而是多種危險因素相互作用的結果，其中遺傳和環境因素受到關注［4-6］。目前缺血性腦卒中的治療方法有限，改變獲得性危險因素進行一級預防以降低缺血性腦卒中的病死率和發病率顯得尤為重要。對高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、酗酒、心臟病等缺血性腦卒中的傳統危險因素進行適當的處理，雖然對降低缺血性腦卒中發病率起到部分作用，但作用有限，目前來看并不能明顯降低卒中發生率［7-9］。近年來大量相關研究集中在遺傳變異與缺血性腦卒中易感性之間的關系上。

亞甲基四氫葉酸還原酶參與氨基酸和嘌呤生物合成途徑，是血同型半胱氨酸代謝過程中所必需的還原酶，在同型半胱氨酸與蛋氨酸的代謝循環過程中起催化5，10-亞甲基四氫葉酸的作用，使其轉化為生成蛋氨酸所必需的5-甲基四氫葉酸［12-13］。亞甲基四氫葉酸還原酶基因（methylenetetrahydrofolate reductase gene，MTHFR）定位于染色體位置1p36.3［10-11］，該基因的C677T位點具有多態性，MTHFR基因677核苷酸C-T 替換的常見突變（rs1801133，C667T），該突變與酶活性降低有關，從而影響5-甲基四氫葉酸的生成，阻礙同型半胱氨酸的再甲基化，導致體內同型半胱氨酸升高［14-15］。研究報道，高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia）是多種疾病的間接或直接危險因素，近年來大量研究探討了高同型半胱氨酸與缺血性腦卒中之間的關系［16-19］，并已確定高同型半胱氨酸血癥是缺血性腦卒中獨立危險因素之一［5］。雖然與同型半胱氨酸代謝密切相關的MTHFR C677T變異被提出可能與血漿同型半胱氨酸水平之間有相互協調作用，導致缺血性腦卒中的患病風險增高，但目前并沒有大家一致認同的準確結論［16，20-22］。這些沖突的結果可能是由于樣本量小、民族多、缺乏對生活方式的考慮。本研究探討MTHFR 基因多態性在IS 中的作用，并將這些結果與IS患者的血漿Hcy水平進行關聯分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2019-09-12—2021-09-15于大連大學附屬新華醫院神經內一科就診的84例IS患者為實驗組。所有受試者為新診斷的缺血性腦卒中患者，并經嚴格的計算機斷層掃描（CT）或磁共振（MR）腦成像證實。患者被證實有腦出血或其他伴隨的嚴重內科疾病，如惡性腫瘤、嚴重肝腎功能障礙、惡性貧血和自身免疫性疾病，則被排除在外。另選100 例無卒中史的健康體檢者為對照組。所有參與研究者均已簽署知情同意書，研究方案由大連大學附屬新華醫院倫理委員會審核批準。

1.2 方法 取患者空腹血液，離心留上層血清。使用半胱氨酸含量檢測試劑盒，取0.2 mL 血清加試劑盒自配現成提取液0.3 mL，充分混勻，提前將離心機預冷，離心，取血清，待測。分光光度計預熱，調零，然后將標準品加入0.826 mL 蒸餾水得到100 μmol/mL 的標準液，然后加水按不同濃度梯度稀釋標準溶液。取出18個實驗管分為6個測定管、6個標準管、6個空白管，3個一組。不同濃度標準溶液分別加入管中，測定管中加入200 μL樣本，500 μL試劑一，300 μL試劑二；標準管中加入200 μL 標準品、500 μL 試劑一、300 μL 試劑二；空白管中加入200 μL蒸餾水、500 μL試劑一、300 μL 試劑二。靜置后測吸光值，繪圖求值。

1.2.1 MTHFR 基因分型檢測：使用重慶京因生物科技有限責任公司生產的全自動醫用PCR 分析系統，取受試者口腔脫落細胞，取樣前確認受試者無口腔牙齦出血，囑其清水漱口2 次，每次不少于5 s，漱口后吞咽2～3 次，盡量避免口腔內壁殘留唾液。取樣的拭子90°接近口腔內腮壁，均勻刮5 次，上下為1次。取樣后立即將樣本放入反應液中，隨后上機檢測，根據全自動醫用PCR 分析系統使用說明書，使用分析軟件對采集的數據進行分析，得出MTHFR C677 的基因型檢測結果。

1.2.2 收集資料：經過專門訓練的采訪者編制一份標準化的問卷，對所有參與者進行仔細的遺忘評估和體檢。所有患者在發生缺血性腦卒中時進行全面的病史、體格檢查和臨床生化分析，記錄缺血性腦卒中的各種相關危險因素。

1.3 統計學分析 使用統計軟件SPSS 20.0進行統計分析。連續數據用均值±標準差（±s）表示，分類數據用百分比（%）表示。連續變量間比較使用t 檢驗，用卡方檢驗評估分類變量之間的差異。使用單變量和多變量Logistic回歸估計缺血性腦卒中與任何混雜因素之間的比值比（OR）和95%可信區間（CI）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

缺血性腦卒中患者高血壓、糖尿病、血脂異常和高同型半胱氨酸血癥的患病率明顯更高（P＜0.05）。2 組間吸煙（P=0.21）、飲酒無顯著差異（P=0.37），與IS 患者相比，對照組吸煙更多。實驗組血漿總同型半胱氨酸水平明顯高于對照組（P＜0.001）。TT 和CT基因型組高同型半胱氨酸血癥患病率和同型半胱氨酸水平顯著高于CC 基因型組（P＜0.001）。見表1。

表1 2組臨床資料比較 ［n（%）］Table 1 Comparison of clinical data of two groups ［n（%）］

TT 基因型（6%）在缺血性腦卒中患者中與風險增加相關（P=0.2，OR=2.1），缺血性腦卒中患者MTHFR C677T的CT+TT等位基因頻率（49%）明顯高于對照組（40%）（P=0.01，OR=2.1）。見表2。

表2 實驗組和對照組MTHFR C677T等位基因和基因型頻率比較 ［n（%）］Table 2 Comparison of Allele and genotype frequencies of the MTHFR C677T polymorphisms in experimentals and controls ［n（%）］

IS 患者血漿Hcy 平均水平明顯升高（OR=109，P＜0.001），超過1/2的缺血性腦卒中患者有高同型半胱氨酸血癥（tHcy＞15μmol/L），而只有1%的對照組人員Hcy 水平異常升高，見表3。

表3 實驗組和對照組同型半胱氨酸水平比較Table 3 Homocysteine levels in the experimentals and controls

將TT、CT、CC 3 種677T 等位基因的血漿Hcy水平進行對比發現，TT攜帶者的血漿Hcy平均水平明顯高于野生型CC患者。見表4。

表4 MTHFR C677T多態性對血漿同型半胱氨酸濃度的影響Table 4 Influence of MTHFR C677T polymorphisms on plasma homocysteine concentration

3 討論

缺血性腦卒中的病因機制相當復雜，不是單一因素所決定的，而是多種因素相互作用的結果，目前討論最多的是環境因素、生活習慣因素和遺傳因素等［4，8］。目前認為與缺血性腦卒中相關的遺傳異常可能在不同遺傳背景的個體中是不相同的，MTHFR C677T 的突變可能參與其中一小部分。雖然全球多個地域已對該基因相關的多種疾病進行了大量研究，但這種突變作為IS 的危險因素的作用還有爭議［20-22］。本研究發現，MTHFR C677T 位點變異與缺血性腦卒中相關，且其危害性不論是導致血漿同型半胱氨酸的升高還是導致缺血性腦卒中的易感性均與該位點的T 基因頻率有關。此外，其他幾個與生活習慣和環境影響相關的危險因素也與缺血的風險相關。

高血漿同型半胱氨酸已被證明是缺血性腦卒中的獨立危險因素［5］，目前大量研究表明MTHFR C677T 多態性與之相關，且具有MTHFR TT 基因型的受試者酶活性較低可能是兩者因果關系的原因［16-17］。根據這些研究結果提出MTHFR C677T多態性與缺血性腦卒中風險之間存在相關性的可能性。血漿同型半胱氨酸水平升高與MTHFR C677T多態性的存在有關，這可能與新加坡、馬來西亞、突尼斯、中國和波蘭人群缺血性腦卒中風險的增加有關［23-24］。然而，在土耳其、贊比亞和巴西人群中，MTHFR C677T 多態性與缺血性腦卒中的風險之間未觀察到相關性［25-26］。即使是在同一個國家，如印度人對缺血性腦卒中的易感性也有很大的不同，既有降低的風險，也有增加的風險［27-28］。在土耳其人口中，也可以觀察到同樣的不一致性［29-30］。雖然所有這些研究結果之間的差異尚不清楚，可能是由于樣本量的差異，或是MTHFR途徑需要的輔助因子，如葉酸或維生素B12的種族差異和營養攝入差異［31-32］。本研究顯示，MTHFR C677T 的T 變異攜帶者與缺血性腦卒中易感性顯著相關，與以往大多數研究一致，假設MTHFR C677T 的遺傳風險變異可能通過聯合調節同型半胱氨酸水平來影響缺血性腦卒中的風險，但需進一步研究揭示MTHFR C677T多態性在缺血性腦卒中中調控的確切機制。

研究認為，生活方式和基因構成均會影響缺血性腦卒中的遺傳易感性。許多傳統的危險因素，如高血壓、糖尿病和高脂血癥等與缺血性腦卒中的風險增加有關，這些因素都是可以改變或避免的。本研究通過多因素Logistic回歸分析發現，除吸煙與喝酒以外的5個傳統危險因素均與卒中風險相關，作為近年來被確定為缺血性腦卒中風險因素的高同型半胱氨酸血癥也在本研究中被證實是缺血性腦卒中的危險因素［8，18］。吸煙、喝酒作為已被眾多試驗證明的缺血性腦卒中危險因素在本研究中結果無意義可能與研究樣本量有限相關。本研究表明，MTHFR C677T 多態性以及高同型半胱氨酸血癥均與IS 相關，需要進一步的大規模研究調查缺血性腦卒中的其他遺傳危險因素以及其可能與Hcy 水平變化的協同作用或影響。如果MTHFR C677T突變與缺血性腦卒中風險確有相關性，對有缺血性腦卒中遺傳易感的高危人群的識別將促進缺血性腦卒中防治策略的制定。

本研究不同以往取患者空腹血液進行PCR檢測基因的方式，選擇提取口腔脫落細胞進行檢測，是一種更加簡單快速且減少患者痛苦的方式，檢測所使用的儀器是由與首都醫科大學附屬北京天壇醫院王擁軍教授CHANCE-2 研究合作的京因公司提供的專門用來檢測CYP2C19 和MTHFR C677 等基因的PCR 儀器，快速準確。本研究有以下局限性：第一，完成病例數量有限，且不同地區和種族的患者結果可能存在差異，需要擴大研究群體；第二，無法準確了解患者飲食習慣，涉及到葉酸攝入量的影響；第三，選擇只研究MTHFR C677T 基因的多態性，但缺血性腦卒中是一種復雜的疾病，在個體中只研究一種基因缺乏說服力，多種基因型的累積效應以及特定基因和環境之間的相互作用可能會導致缺血性腦卒中事件的發生。