視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病緩解期患者外周血補(bǔ)體C5a及相關(guān)細(xì)胞因子水平與神經(jīng)損傷的相關(guān)性

仝延萍 楊 濤 王靜文 趙天佑 康越之 樊永平△

1）首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100070 2）北京市密云區(qū)中醫(yī)院，北京 101599

視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病（neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD）是一種累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的自身免疫性炎性脫髓鞘疾病，臨床表現(xiàn)以視神經(jīng)和脊髓受累為主的各種神經(jīng)功能缺損癥狀，70%以上的患者為復(fù)發(fā)型，癥狀累加，致殘率高，預(yù)后差［1-2］。視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）曾被認(rèn)為是多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）的一種亞型，隨著NMO-IgG［3］及相應(yīng)靶抗原水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）［4］的發(fā)現(xiàn)，越來越多的證據(jù)證實(shí)兩者在免疫機(jī)制、病理特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)、神經(jīng)影像學(xué)及治療等方面均有較大不同。2015 年，國際NMO 診斷小組將NMO單獨(dú)定義取消，將NMO整合進(jìn)更廣義的NMOSD 范疇中，制定了NMOSD 診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。

NMOSD的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。在人類CNS 的NMO 樣病灶中早期可見AQP4 和膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白丟失，病灶內(nèi)B 細(xì)胞、少量CD3+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，血管周圍有大量中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞浸潤以及免疫球蛋白和激活的補(bǔ)體復(fù)合物沉積［6］。研究發(fā)現(xiàn)，NMOSD 患者急性發(fā)作期腦脊液中有大量中性粒細(xì)胞［6-7］。C5是所有補(bǔ)體激活途徑共有的后續(xù)活化補(bǔ)體組分，C5a 是補(bǔ)體C5 的裂解產(chǎn)物，是超強(qiáng)炎癥介質(zhì)，NMO 患者腦脊液中C5a 水平顯著增高，C5a的受體（C5aR）主要分布在中性粒細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞等炎癥反應(yīng)細(xì)胞的表面［8］，C5a 與受體結(jié)合可促進(jìn)補(bǔ)體從血管中滲出及炎性細(xì)胞的遷移，促進(jìn)炎性因子的釋放，使中性粒細(xì)胞活化，促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒、引導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移，促進(jìn)NMO病灶的擴(kuò)大和炎癥過程的延長［6，9-10］。然而，目前NMOSD中性粒細(xì)胞功能異常的研究多關(guān)注急性發(fā)作期［11-12］，關(guān)于NMOSD 緩解期C5a 與相關(guān)炎性因子變化以及中性粒細(xì)胞活化情況研究甚少。因此，本研究納入NMOSD 緩解期患者及健康對照，分析緩解期NMOSD 患者外周血C5a 與相關(guān)炎性因子變化情況及其與患者神經(jīng)功能損傷水平的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2017-02—2018-04 就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院的NMOSD患者90例，同時招募45名健康志愿者作健康對照（healthy control，HC）組。所有受試者均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）NMOSD 患者符合2015 年國際NMO診斷小組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）病情處于緩解期，且無復(fù)發(fā)跡象。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重心、肝、腎功能不全及其他影響生命體征平穩(wěn)的疾病患者；（2）妊娠期或哺乳期患者；（3）研究者認(rèn)為不適合參加該試驗(yàn)的任何其他情況。

共納入緩解期NMOSD 患者90 例，女81例，男9 例，女男比例9∶1；年齡（39.6±1.4）歲，發(fā)病年齡（36.7±1.4）歲；病程（2.92±0.5）a，復(fù)發(fā)次數(shù)（1.93±0.4）次，ARR（0.82±0.1）次/a，EDSS評分（3.8±0.2）分。HC組45例，女34例，男11例；女男比例3.1∶1，年齡（35±1.26）歲。

1.2 研究方法 （1）臨床資料采集：采集患者基本信息、發(fā)病年齡、病程、發(fā)作次數(shù)等資料，計算平均年復(fù)發(fā)率（annualized relapse，ARR；某階段復(fù)發(fā)次數(shù)/某階段時間，單位：次/年），應(yīng)用擴(kuò)展殘疾量表（expanded disability status scale，EDSS）評分評估患者神經(jīng)功能損傷情況。（2）標(biāo)本采集與檢測：受試者清晨空腹采血，取靜脈血，3 mL 用乙二胺四乙酸抗凝；3.5 mL 不加抗凝劑。2 500 r/min，離心10 min，取上清，分別留取血清、血漿，—80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?血漿C5、C5a、細(xì)胞因子白介素（interleukin，IL）1 β 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）α應(yīng)用多因子檢測試劑盒（美國默克密理博公司，貨號HCMP1MAG、HCYTOMAG）檢測，血清中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）水平應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（英國Abcam 公司，貨號ab119553）檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 22.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有的統(tǒng)計檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±se）表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，正態(tài)分布數(shù)據(jù)兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)2 組數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；應(yīng)用多元線性回歸分析，分別以NMOSD 緩解期患者的連續(xù)性結(jié)局指標(biāo)復(fù)發(fā)次數(shù)、EDSS 評分、ARR 為因變量（Y），以C5a 和NE 表達(dá)水平為自變量（X），同時納入可能影響結(jié)局變量的性別、年齡、病程共同分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血C5 與其裂解產(chǎn)物C5a 及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平 NMOSD 組和HC 組受試者外周血血漿中補(bǔ)體分子C5的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.12），但其裂解產(chǎn)物C5a的表達(dá)水平NMOSD組顯著高于HC組（P＜0.000 1），緩解期NMOSD 組血漿炎癥因子IL-1 β 和TNF-α亦顯著高于HC組（P＜0.001，P=0.004），血清NE 表達(dá)水平緩解期NMOSD 組較HC 組顯著增高（P=0.008）。見表1、圖1。

圖1 HC組與NMOSD組外周血C5與裂解產(chǎn)物C5a及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平Figure 1 Peripheral blood C5 and lysate C5a and related cytokine expression levels in HC group and NMOSD group

表1 HC組與NMOSD組外周血C5與裂解產(chǎn)物C5a及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平 （±se）Table 1 Peripheral blood C5 and lysate C5a and related cytokine expression levels in HC group and NMOSD group （±se）

表1 HC組與NMOSD組外周血C5與裂解產(chǎn)物C5a及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平 （±se）Table 1 Peripheral blood C5 and lysate C5a and related cytokine expression levels in HC group and NMOSD group （±se）

注：與HC組相比，**P＜0.01

組別HC組NMOSD組血清NE/（pg/mL）1 400±70 1 580±50**n 45 90血漿C5/（ng/mL）22.48±0.47 24.6±0.60血漿C5a/（ng/mL）0.78±0.027 1.09±0.044**血漿IL-1β/（pg/mL）0.77±0.04 1.17±0.06**血漿TNF-α/（pg/mL）14.93±0.68 20.75±1.14**

2.2 緩解期NMOSD 患者外周血C5a 和NE表達(dá)水平與不同臨床結(jié)局的多元回歸分析在緩解期NMOSD 患者中，以臨床結(jié)局復(fù)發(fā)次數(shù)、ARR 和EDSS 評分為因變量，以C5a 和NE表達(dá)水平為自變量，控制性別、年齡和病程后進(jìn)行多元回歸分析。結(jié)果顯示，NE 表達(dá)水平與EDSS 評分顯著相關(guān)（R2=0.29，P=0.00），年齡是影響EDSS評分的獨(dú)立因素（P=0.03），C5a表達(dá)水平與復(fù)發(fā)次數(shù)、ARR和EDSS評分無明顯相關(guān)性。見表2、圖2。

圖2 NMOSD患者C5a和NE表達(dá)水平與復(fù)發(fā)次數(shù)、ARR和EDSS評分的多元線性回歸分析，因變量（Y縱軸變量）與標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)測值（X軸變量）散點(diǎn)圖Figure 2 Multiple linear regression analysis of C5a and NE expression levels and recurrence times，ARR and EDSS scores in NMOSD patients，scatter plot of dependent variable（Y vertical axis variable）and standardized predicted value（X axis variable）

表2 NMOSD患者C5a和NE表達(dá)水平與復(fù)發(fā)次數(shù)、ARR和EDSS評分的多元線性回歸分析Table 2 Multiple linear regression analysis of C5a and NE expression levels and recurrence times，ARR and EDSS scores in NMOSD patients

3 討論

NMOSD是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性炎性脫髓鞘疾病，在任何年齡均可發(fā)病，中位發(fā)病年齡39 歲，青春期前患者無性別差異，青春期后女性患者居多，占患者總數(shù)的70%～90%［1-2，13-14］。與AQP4-IgG 相關(guān)的NMOSD 相比，MOG-IgG相關(guān)的NMOSD在男性和年齡較小個體中更常見［15］。本病一般呈急性或亞急性起病。約50%的患者以孤立性視神經(jīng)炎起病，出現(xiàn)顯著視力下降或視野缺損，其中約20%為雙側(cè)。部分患者表現(xiàn)為孤立的脊髓炎，在數(shù)小時至數(shù)天內(nèi)出現(xiàn)四肢或軀干的感覺、運(yùn)動功能障礙，并常出現(xiàn)腸道或膀胱功能障礙。約10%的NMO患者首發(fā)癥狀是視神經(jīng)炎與脊髓炎并見［16］。NMOSD 70%以上的患者為復(fù)發(fā)型而非單時相病程，疾病反復(fù)發(fā)作，發(fā)作后殘疾疊加，為患者、家庭和社會帶來極大負(fù)擔(dān)。

AQP4-IgG 是NMOSD 的特異性抗體。人類NMO 病灶周圍常聚集有豐富的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，均可通過引起抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用參加補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用［17］。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，向小鼠腦內(nèi)注射從NMO 患者血清中提純的AQP4-IgG和人補(bǔ)體可形成特征性NMO病灶，而同時注射AQP4-IgG 和鼠補(bǔ)體不能引起特征性NMO樣CNS損傷，且向AQP4基因敲除鼠注射NMO-IgG 和人補(bǔ)體亦未產(chǎn)生NMO 樣病灶，說明AQP4 及其抗體、人類補(bǔ)體同時存在是NMO 病灶形成的必要條件［9］，補(bǔ)體依賴的星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用是誘發(fā)神經(jīng)炎癥與脫髓鞘過程的主要機(jī)制。C5是所有補(bǔ)體激活途徑共有的后續(xù)活化補(bǔ)體組分，其裂解產(chǎn)物之一C5a是效應(yīng)最強(qiáng)的補(bǔ)體來源炎癥介質(zhì)，其受體C5aR主要分布于中性粒細(xì)胞等炎癥反應(yīng)細(xì)胞的表面，C5a 與靶細(xì)胞表面C5aR 結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。在CNS 中，C5a 可破壞血-腦脊液屏障（blood brain barrier，BBB），增加BBB通透性，促進(jìn)補(bǔ)體從血管中滲出及炎性細(xì)胞的遷移［18］。人類及動物NMO模型神經(jīng)病理研究發(fā)現(xiàn)，由C5a誘發(fā)的炎癥反應(yīng)又可促進(jìn)C5a的產(chǎn)生，形成正反饋循環(huán)，促進(jìn)NMO病灶的擴(kuò)大和炎癥過程的延長。C5a/C5aR信號通路可增加炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6等的產(chǎn)生，還可抑制中性粒細(xì)胞凋亡，延緩炎癥的消退［6，9，19-23］。本研究中緩解期NMOSD患者外周血C5a表達(dá)水平顯著高于健康對照者，且存在炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的異常升高，提示緩解期NMOSD 患者體內(nèi)仍存在C5a/C5aR 通路的異常激活和炎性環(huán)境的紊亂。

NE 是一種細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白酶，由中性粒細(xì)胞在其活化后釋放，NE 異常和過量釋放進(jìn)入組織后可導(dǎo)致各種急慢性炎癥性疾病。正常生理情況下中性粒細(xì)胞被BBB隔離在CNS實(shí)質(zhì)之外［24］。中性粒細(xì)胞向CNS 募集并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)髓鞘脫失、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等功能，在NMOSD 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［7，25］。有研究發(fā)現(xiàn)，NMO患者在緩解期時其腦脊液中性粒細(xì)胞水平仍較正常升高20%［26］，動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)注射NE抑制劑可顯著減輕AQP4-IgG 和人補(bǔ)體注射形成的特征性NMO病灶的損傷嚴(yán)重程度［7，26］。團(tuán)隊(duì)前期研究顯示，NMO 緩解期患者外周血中具有很強(qiáng)粒細(xì)胞趨化作用的上皮中性粒細(xì)胞激活肽78水平較正常增高［27］，提示緩解期NMOSD 存在中性粒細(xì)胞的功能異常。本研究發(fā)現(xiàn)，緩解期NMOSD患者血清NE表達(dá)水平顯著升高，提示存在著中性粒細(xì)胞的異常活化。

本研究以臨床結(jié)局復(fù)發(fā)次數(shù)、ARR 和EDSS評分為因變量，以C5a和NE表達(dá)水平為自變量，控制性別、年齡和病程后，進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果顯示，NE 表達(dá)水平與患者EDSS評分顯著正相關(guān)，年齡是影響EDSS 評分的獨(dú)立因素，未發(fā)現(xiàn)C5a 表達(dá)水平與復(fù)發(fā)次數(shù)、ARR 和EDSS 評分相關(guān)性。這提示雖然緩解期NMOSD 患者病情較為穩(wěn)定，無明顯急性CNS炎癥表現(xiàn)，但患者體內(nèi)仍存在著中性粒細(xì)胞的異常活化與炎性環(huán)境的紊亂，中性粒細(xì)胞的異常活化對患者神經(jīng)功能損傷具有不良影響。

本研究證實(shí)了緩解期NMOSD患者仍存在著C5a 異常升高所導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞異常活化和炎性因子的異常升高，血清NE 表達(dá)水平可能是反映NMOSD臨床預(yù)后的核心指標(biāo)之一。