不同病例來源肺炎克雷伯菌的致病性及其遺傳進化關系分析

孫弋雅，周方圓，周明玉，劉海月，王大為，劉英姿

(1.錦州醫科大學；2.錦州醫科大學醫療學院，遼寧 錦州 121000)

肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，KP)是最早在19世紀末由Friendiander發現，它屬于腸桿菌科，克雷伯菌屬，廣泛存在于水和土壤中，近年來成為僅次于大腸桿菌的最重要的條件性致病菌，可以感染人類及各種動物。當機體免疫力下降時在全身各個部位可發生感染[1]，除了最常見的呼吸系統、泌尿系統感染，還可引發肝膿腫、腦膿腫、腦膜炎、眼炎等疾病[2]。近些年，由于抗菌藥物的廣泛使用，導致肺炎克雷伯菌的耐藥越來越嚴重，所以，本病不僅多發而且敏感藥物越來越少[3-4]。目前針對該菌的致病因子和耐藥性的研究已有一些報道，但關于其致病力、親緣關系、耐藥性的關系研究還不多見，因此，本研究針對臨床不同病例來源肺炎克雷伯菌，開展致病性及其遺傳進化關系分析，為探索肺炎克雷伯菌的傳播來源和致病機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

選取錦州醫科大學附屬第一醫院發熱患者、硫化氫中毒患者、腦梗死患者、腦血管病患者及膽腸吻合口結石患者病例的檢驗樣品，檢驗科通過細菌學分離培養得到5株疑似肺炎克雷伯菌，菌株編號、來源與科室見表1。

表1 菌株編號及來源

1.2 實驗動物

18～22 g SPF級昆明小鼠42只，購自錦州醫科大學動物實驗中心；3日齡海蘭褐健康雛雞42只，購自錦州某雞白痢凈化種雞場，經過常規細菌學和常見病毒核酸檢測呈陰性，飼養于獸醫樓小動物飼養室，環境溫濕度條件和飼料營養按照雛雞飼養標準進行。

1.3 主要儀器試劑

普通營養瓊脂培養基、麥康凱培養基、革蘭氏染色液(青島海博生物技術有限公司)；陰性細菌鑒定卡、0.45% NaCl溶液(法國BIOMERIEUX公司)；細菌基因組DNA提取試劑盒及膠回收試劑盒(杭州博日科技有限公司)；DM2000 DNA Marker、2×Taq Master Mix(北京康為世紀生物科技有限公司)；Gill green核酸染料(華越洋生物科技有限公司)；VITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統(法國生物梅里埃公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1 細菌分離純化、觀察及生化試驗：按常規微生物檢驗方法，應用普通瓊脂培養基和麥康凱培養基對檢驗樣品進行細菌培養和純化。選取疑似菌落，進行革蘭氏染色鏡檢，觀察形態。對純培養物進行保種，使用無菌棉拭沾取3～5個菌落，接種到菌落凍存管中，放入冰箱-80 ℃保存備用。生化試驗采用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀進行生化鑒定，具體方法步驟按說明書進行。

1.4.2 細菌16S rRNA的PCR檢測及其序列遺傳進化關系分析：按細菌基因組DNA提取試劑盒操作提取分離純化后的細菌基因組DNA，使用16S rRNA通用引物(由上海生工生物公司合成)進行目的片段的PCR擴增，引物序列為：27F：5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’；1492R：5’ TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3’。PCR反應總體積為30 μL，2×Taq Master Mix緩沖液15 μL，DNA模板3 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 10 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環，72 ℃總延伸10 min。反應結束后，將PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對符合目的大小的片段進行凝膠回收，并送至上海生工生物公司測序。使用比對軟件DNAMAN(Version 9)、MEGA 5.0等與標準肺炎克雷伯菌序列進行比對分析，并對所分離的5株菌株以及部分動物源菌株進行同源性分析，繪制進化樹。

1.4.3 致病性試驗

1.4.3.1 接種菌液的制備：選取本實驗鑒定純化的肺炎克雷伯菌5株，編號為KP1、KP2、KP3、KP4、KP5復蘇培養，使用滅菌后的鑷子夾取一個磁珠放入無菌營養肉湯培養基中，37 ℃ 160 rpm培養。待菌液渾濁后，用校正后的麥氏比濁儀調至0.5麥氏單位(1.5×108CFU/mL)，吸取一定菌液至滅菌后的EP管中，10 000 rpm離心5 min，棄上清液，用無菌PBS溶液重懸沉淀，重復3次，最后用PBS制成菌懸液備用。

1.4.3.2 致病性試驗：分別將42只小鼠和雛雞隨機分為7組，分別為感染組(KP1～KP5組)、空白對照組和健康對照組，分籠隔離飼養。小鼠和雛雞感染組每只腹腔分別注射0.3 mL和0.5 mL菌懸液，空白對照組分別注射0.3 mL和0.5 mL無菌PBS溶液，健康對照組不作處理。接種后分別在相同環境下隔離飼養，記錄小鼠和雛雞臨床癥狀、死亡情況；對所有小鼠和雛雞進行剖檢并觀察各器官病理變化，同時采集組織樣本進行病理組織切片制作，觀察病理組織學變化。無菌采集肝臟、脾臟、腎臟等發病器官，進行細菌學檢查。

1.4.4 藥物敏感性試驗：使用VITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統和Kirby-Bauer 紙片擴散法進行菌株的藥敏試驗，具體方法按說明書進行。

1.5 統計學方法

實驗數據采用Excel 2003處理，應用SPSS 21.0統計學軟件進行卡方分析，以P<0.01表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 分離培養結果

5株分離菌株編號為KP1、KP2、KP3、KP4、KP5，在普通培養基上生長為中等大小、光滑、具有黏性的乳白色菌落。當菌落距離近時，可相互融合成為菌苔，見圖1A；在麥康凱培養基上形成中等大小、光滑、圓凸的粉紅色菌落，見圖1B；革蘭氏染色后，在顯微鏡下可觀察到菌株呈革蘭氏陰性，兩邊鈍圓的短粗桿菌，單個或雙鏈存在，見圖1C。

圖1 肺炎克雷伯菌生長狀態和形態結構

2.2 生化試驗結果

根據VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀鑒定結果顯示，5株分離菌株均屬于肺炎克雷伯菌肺炎亞種，與肺炎克雷伯菌鑒定標準相似度為99%以上，分離菌株dGLU、dMAL、dMAN、dMNE均為陽性，5株分離菌株的生化實驗結果均符合肺炎克雷伯菌生化試驗特性。

2.3 細菌16S rRNA擴增結果及序列遺傳進化關系分析

分離純化后的菌株經PCR擴增和凝膠電泳后，在1450 bp處出現特異性條帶，與目的大小相符，見圖2。PCR產物經測序后拼接得到目的序列，不同分離菌株經Blast比對與肺炎克雷伯菌同源性高于99%，即確定5株細菌均為肺炎克雷伯菌。不同分離菌株同源性比對結果顯示KP1～KP4同源性為98.85%，其中KP1&KP2&KP4同源性高達99.56%，KP1～KP5同源性為93.42%；遺傳進化樹結果同樣證明KP1～KP4親緣關系較近，KP1-KP4與KP5親緣關系較遠，見圖3。

M：DM2000 marker；1-5：檢測樣本；6：陰性對照

圖3 KP1～KP5遺傳進化樹

2.4 致病性實驗結果

連續1 w觀察小鼠和雛雞的狀態，見表2。小鼠和雛雞感染組(KP1～KP5)均有發病，發病率為100%，死亡率在50%～100%不等；KP3腦梗死病例分離菌株致死率最高為100%，顯著高于其它各組(P≤0.01)；KP5膽腸吻合口結石病例分離菌株致死率最低僅為50%，雛雞KP1組死亡率介于中等水平為83.3%。健康組和空白對照組小鼠和雛雞均未發病。小鼠和雛雞感染組細菌學檢查陽性率為100%。發病小鼠表現為飲食飲水量下降、聚堆、行走困難、眼角有黃色分泌物、四肢末端充血、肛門有糞便黏住、皮下充血水腫、見圖4。主要剖檢變化為：肺臟充血淤血，肝臟淤血變性，腎臟出血變性，脾臟出血壞死，腦實質充血，見圖5。發病雛雞典型癥狀表現為飲食飲水量下降，畏寒，聚堆，鼻腔和嘴有黃色透明液體分泌，四肢末端充血，見圖6。典型剖檢變化肺臟充血淤血，肝臟變性壞死，白細胞滲出，包膜纖維素性炎癥，腎臟出血變性，脾臟出血壞死，腦膜下白細胞滲出，見圖7。

圖4 KP1～KP5組發病組小鼠典型臨床癥狀

A：肺臟充血淤血；B：肝臟淤血變性；C：腎臟出血變性；D：脾臟出血壞死；E：腦實質充血

圖6 KP1～KP5組發病組雛雞典型臨床癥狀

A：肺臟充血淤血；B：肝臟變性壞死；C:腎臟出血變性；D:脾臟出血壞死；E：腦膜下白細胞滲出

表2 小鼠和雛雞致病性試驗結果

2.5 藥敏試驗結果

對不同病例來源所分離的5株肺炎克雷伯菌進行藥敏試驗，其中KP3和KP5兩株為產超廣譜β-內酰胺酶菌，KP2、KP3和KP5表現出多重耐藥性，KP1和KP4較少表現出耐藥性，見表3。

表3 5株肺炎克雷伯菌分離菌藥敏結果

3 討 論

根據相關文獻報道，肺炎克雷伯菌主要通過莢膜多糖(CPS)、脂多糖(LPS)、菌毛、鐵載體系統和外膜蛋白、孔蛋白、尿囊素代謝等致病因子導致人和動物發病。在營養不良和各種疾病導致免疫功能低下時引起呼吸道感染、肺炎、泌尿系感染、肝膿腫、眼內炎、腦膿腫等多種病癥。以小鼠為動物模型開展肺炎克雷伯菌致病性的研究較多[5-6]，但鮮有對不同病例來源菌株的致病力差異及其親緣關系的研究報道；有大量文獻報道關于不同哺乳動物和禽類來源肺炎克雷伯菌分離鑒定和致病性的研究，而未見有針對小鼠以外的其它動物開展人源肺炎克雷伯菌致病性研究。因此，本研究從錦州醫科大學附屬第一醫院采集感染科發熱患者、重癥監控科硫化氫中毒患者、神經內科腦梗死患者、重癥監控科腦血管病患者及膽腸吻合口結石患者不同來源的病例樣品，成功分離鑒定到5株肺炎克雷伯菌，分別以小鼠和雛雞為模型對其致病性進行研究。結果顯示，5株不同病例來源菌株均可引起小鼠和雛雞100%的發病率，死亡率也高達50%～100%。其中腦梗死病例分離菌株致死率最高為100%，膽腸吻合口結石病例分離菌株致死率最低為50%。患病小鼠和雛雞表現的典型癥狀相似，均表現為飲食飲水量下降、聚堆、行走困難、眼角有黃色分泌物，四肢末端充血；且典型病理剖檢變化均為肺臟、肝臟、脾臟、腦充血出血，雛雞還可見肝包膜纖維素性炎癥。研究結果一方面說明不同病例來源肺炎克雷伯菌的致病性存在明顯差異，但為什么腦梗死病例來源菌株致病力最強還需要擴大樣本并進行深入研究。另一方面，說明不同病例來源肺炎克雷伯菌對小鼠和禽類均具有致病性，即說明該菌可通過鼠類和禽類進行疾病傳播，因此在防控過程中必須重視對鼠類和禽類傳播途徑的控制。此外還可應用小鼠和禽類作為多種病例來源肺炎克雷伯菌的動物模型，以此開展致病機制、耐藥性、新藥開發等研究。

本研究顯示，不同病例來源的分離菌株親緣關系有明顯差異，來源于感染科發熱KP1、重癥監控科硫化氫中毒KP2、神經內科腦梗死KP3、重癥監控科腦血管病KP4的菌株同源性較高，為98.85%，尤其是KP1、KP2、KP4同源性為99.56%，但KP1-KP5同源性為93.42%，說明KP1-KP4與膽腸吻合口結石KP5親緣關系較遠，而KP1-KP4均為腸道系統以外的器官病例，可能均為肺炎克雷伯菌繼發感染，是否存在院內感染的情況需要深入研究；而膽腸吻合口結石病例KP5為單獨分支來源，是否與腸道系統微生物菌群有關也有待深入研究。綜合致病性差異結果，發現親緣關系遠近和致病性不完全成正相關，同源性較高但不同菌株也可能有較大的致病性差異，親緣關系較遠的菌株致病性不一定存在明顯差異。

克雷伯菌的耐藥性越來越嚴重且存在地區和時空的差異性[7-8]，本研究結果表明，不同病例來源肺炎克雷伯菌的耐藥性存在較大差異，在5株不同病例來源所分離的肺炎克雷伯菌中神經內科腦梗死KP3和KP5兩種菌株為產超廣譜β-內酰胺酶菌，KP2、KP3和KP5 3種菌株表現出多重耐藥性，KP1和KP4兩種菌株表現耐藥性較少。結合上述致病性和親緣關系研究結果，發現耐藥性與致病性和親緣關系沒有必然聯系，與何紅、陳娜、宋曉超等研究結果一致[9-12]。雖然有許多關于耐藥性與毒力因子之間的關系研究[13-15]，但其必然聯系仍不明確，因此，針對肺炎克雷伯菌的同源性、血清型、毒力因子、致病力、耐藥性及耐藥基因以及與感染病例免疫指標、血液生化指標等之間的聯系均需要進一步研究。