透明質(zhì)酸寡糖軟膏的制備及藥效學(xué)研究

許放，王洪新，郭斌

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院；2.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000)

透明質(zhì)酸(hyaluronic，HA)是一種由葡糖醛酸和N—乙酰氨基葡糖的雙糖單位重復(fù)連接構(gòu)成的酸性黏多糖。HA通過(guò)降解可以得到O-HA，酶解法是制備透明質(zhì)酸寡糖最溫和的降解方法[1]。HA寡糖是相對(duì)分子質(zhì)量<10 000、單糖殘基數(shù)為2～40(一般為4～16)的HA分子片段[2]，屬于小分子多糖，其性質(zhì)與普通透明質(zhì)酸有很大不同，甚至具有完全相反的作用。其生物活性主要有促血管生成、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等。目前有關(guān)透明質(zhì)酸寡糖在傷口愈合中的作用研究較少，本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)及組織學(xué)的觀察，證實(shí)了透明質(zhì)酸寡糖對(duì)傷口愈合的作用，為透明質(zhì)酸寡糖的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新西蘭大耳白兔，2～3 kg錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑：透明質(zhì)酸寡糖(純度≥95%，分子量758.63)，山東省藥學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。液體石蠟，天津市大茂試劑廠。硬脂酸，天津永晟精細(xì)化工有限公司。黃凡士林，南昌華鑫醫(yī)藥化工有限公司。十二烷基硫酸鈉，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。丙三醇，天津永晟精細(xì)化工有限公司。尼泊金甲酯，浙江圣效化學(xué)品有限公司。羊毛脂，三乙醇胺，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。TGF-β一抗，即用型SABC--POD二抗試劑盒，DAB顯色試劑盒武漢博士德生物工程有限公司。積雪苷霜軟膏(國(guó)藥準(zhǔn)字Z3102056，批號(hào)20180731，上海現(xiàn)代制藥股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 軟膏制備方法

1.2.1.1 軟膏基質(zhì)篩選[3-4]

表1 軟膏基礎(chǔ)處方篩選

1.2.1.2 正交試驗(yàn)因素與水平的確定：由以上實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，配方2為最適宜軟膏基質(zhì)。根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5]，確定考察因素為單硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸鈉、液體石蠟，選用L9(33)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。評(píng)價(jià)指標(biāo)[6]分別為軟膏的外觀(占總分的40%)，分層時(shí)間(占總分的20%)，耐寒耐熱穩(wěn)定性(占總分的20%)。按照正交試驗(yàn)結(jié)果確定軟膏基質(zhì)處方為試驗(yàn)7。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

1.2.1.3 制備工藝：取黃凡士林2.00 g、硬脂酸2.10 g、單硬脂酸甘油酯1.60 g、液狀石蠟2.50 g水浴加熱至75 ℃，制成油相，再取甘油2.00 g、十二烷基硫酸鈉0.20 g、尼泊金甲酯0.02 g、蒸餾水9.60 mL加熱至85 ℃，制成水相，將透明質(zhì)酸寡糖0.06 g加入水相，攪拌使溶解。然后將水相混合液緩緩加到油相緩沖液中，邊加邊攪拌，冷凝，即得透明質(zhì)酸寡糖軟膏。

1.2.2 藥效學(xué)分析方法

1.2.2.1 動(dòng)物模型制作[7]：將新西蘭大耳白兔經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg)，麻醉顯效后，剔除毛發(fā)，常規(guī)消毒，于每只兔耳腹側(cè)面同一部位畫(huà)出直徑為1 cm的圓，并切除圓內(nèi)皮膚，保留軟骨膜及軟骨。

造模后每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌注青霉素4000 U，每日1次，注射2次。造模后即開(kāi)始用藥，12只動(dòng)物隨機(jī)分成6組，每組2只，分別涂以透明質(zhì)酸寡糖軟膏高濃度、中濃度、低濃度、積雪苷霜軟膏、基質(zhì)，其中每組有1只兔耳作為空白對(duì)照。傷口每天酒精消毒后換藥，每日3次，每只兔分籠飼養(yǎng)。

1.2.2.2 傷口愈合評(píng)價(jià)[8-9]：其中6只兔分別于造模當(dāng)天及造模后的第3、7、14天，對(duì)各個(gè)創(chuàng)面進(jìn)行拍照，以圖像分析軟件Image-pro-plus 4.5處理圖片，得出每個(gè)傷口愈合面積，從而計(jì)算傷口愈合率，傷口愈合率 =〔(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積〕×100%。剩余6只兔分別于建模后的第3、7、14天，創(chuàng)傷組織局部取材，常規(guī)固定、包埋、切片經(jīng) HE 染色。

1.2.2.3 免疫組織化學(xué)染色：應(yīng)用SABC免疫組織化學(xué)方法，石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育15 min后進(jìn)行高壓抗原修復(fù)。滴加5%封閉血清孵育10～15 min，甩去，不需洗滌。兔抗兔TGF-β1、生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液37 ℃孵育10～30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，步驟同上。每組切片隨機(jī)抽取8個(gè)高倍鏡視野(×400)，用 Image-ProPlus Version 6.0圖像分析軟件測(cè)定平均光密度值，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)創(chuàng)面肉眼觀察

造模后各組創(chuàng)面見(jiàn)少量滲血，第1、2天，各組創(chuàng)面均無(wú)明顯變化，創(chuàng)面周圍略腫。第4天，空白對(duì)照組仍無(wú)明顯變化，有少量滲出液。各濃度透明質(zhì)酸寡糖軟膏組及陽(yáng)性藥物組出現(xiàn)淡黃色分泌物，創(chuàng)面出現(xiàn)收縮。第7天，高濃度透明質(zhì)酸寡糖組創(chuàng)面紅潤(rùn)，創(chuàng)周結(jié)痂，創(chuàng)面收縮速度明顯快于其他組，空白組傷口收縮不明顯。第14天，各濃度透明質(zhì)酸寡糖軟膏組及陽(yáng)性藥物組創(chuàng)面干燥，創(chuàng)周有輕微瘢痕，其中高濃度組創(chuàng)面愈合面積明顯大于其他組，空白組創(chuàng)面邊緣有收縮，但仍有大部分未愈合。

2.2 創(chuàng)面愈合率 見(jiàn)表4。

表4 各組各時(shí)間點(diǎn)傷口愈合率比較

2.3 組織學(xué)觀察

造模后第1、2天，6組傷口肉芽組織增生較少，6組之間比較未見(jiàn)明顯差異。造模后第7天，高濃度透明質(zhì)酸寡糖軟膏組肉芽組織增生程度明顯高于其他組，空白組上皮增生不明顯，造模后第14天，各濃度透明質(zhì)酸寡糖組及陽(yáng)性藥物組有較多肉芽組織形成，創(chuàng)面內(nèi)可見(jiàn)大量新生血管生長(zhǎng)，新生組織細(xì)胞排列緊密，空白組表皮仍有缺損，高濃度透明質(zhì)酸寡糖組愈合效果優(yōu)于其他組，見(jiàn)圖1。

高濃度組(第14天) 中濃度組(第14天) 低濃度組(第14天)

2.4 TGF-β蛋白質(zhì)免疫組化結(jié)果

TGF-β蛋白質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)胞漿呈現(xiàn)棕黃色。高、中、低濃度組、陽(yáng)性藥物組和基質(zhì)組TGF-β蛋白質(zhì)平均光密度值比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明高、中、低濃度組、陽(yáng)性藥物組對(duì)創(chuàng)面愈合都有作用。TGF-β在第14天表達(dá)最高，基質(zhì)組略有TGF-β蛋白質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)，但和空白組比較，無(wú)顯著性差異，排除了空白組對(duì)創(chuàng)面愈合的干擾，見(jiàn)表5、圖2。

表5 各組TGF-β蛋白質(zhì)免疫組化結(jié)果

高濃度組(第14天) 中濃度組(第14天) 低濃度組(第14天)

3 討 論

由于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、交通業(yè)及體育事業(yè)的高速發(fā)展，各種事故所造成的創(chuàng)傷日趨增多。創(chuàng)傷不僅發(fā)生率高，而且程度差別很大，傷情可以嚴(yán)重而復(fù)雜，甚至危及傷員的生命。創(chuàng)傷同心血管疾病及癌癥已成為目前造成死亡的三大原因，如何有效促進(jìn)傷口愈合是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界亟待解決的問(wèn)題。本研究主要是考察透明質(zhì)酸寡糖在制備成軟膏劑型后在傷口愈合方面的功效。

傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種細(xì)胞以及生長(zhǎng)因子的相互作用,包括炎癥階段，增殖階段，組織重塑階段[10]。其中TGF-β的作用受到越來(lái)越多的重視。

對(duì)于皮膚缺損模型，在造模后肌注青霉素屬常規(guī)預(yù)防操作，青霉素本身對(duì)傷口愈合無(wú)作用，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組無(wú)影響。傷口愈合過(guò)程伴隨著肉芽組織增生及傷口面積的減小，通過(guò)測(cè)量傷口面積的大小，計(jì)算傷口愈合率可以評(píng)價(jià)其對(duì)傷口愈合作用的快慢[11]。本研究通過(guò)比較3種不同濃度的透明質(zhì)酸寡糖軟膏組、陽(yáng)性藥物組、基質(zhì)組以及空白組的傷口愈合率，可以看出在傷口愈合早期(1～2 d),各組間差異不明顯，創(chuàng)面以充血為主。在傷口愈合中期(5～7 d)，透明質(zhì)酸高濃度組的傷口愈合明顯快于其他組，可能與透明質(zhì)酸寡糖促進(jìn)血管生成的作用有關(guān)[12]。在傷口愈合后期，空白組的愈合速度明顯慢于其他組。

通過(guò)組織學(xué)的觀察，在傷口愈合中期，不同濃度的透明質(zhì)酸寡糖組及陽(yáng)性藥物組肉芽組織增生較多，新生血管增多，這是促進(jìn)傷口愈合的原因。通過(guò)此研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸寡糖軟膏確實(shí)有促進(jìn)傷口愈合的作用。