AR患者外周血中Th17細胞表面程序性細胞死亡受體-1的表達變化

柳先知，翟亞莉，陳冬

(1.錦州醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科，遼寧 錦州 121000；2.商丘市第三人民醫院耳鼻咽喉科，河南 商丘 476000)

過敏性鼻炎(AR)是指機體接觸過敏原后由免疫球蛋E(IgE)為主要介導的鼻部變態反應性疾病，主要表現有鼻塞、鼻癢、連續性打噴嚏及大量水樣涕[1]。目前AR的全球患病率約為10%～25%，對人們的生活質量及健康產生重大影響，已成為各國亟待解決的全球性社會問題。AR主要是一種 I 型變態反應性疾病，傳統觀念認為Th1/Th2細胞免疫失衡在AR的發病機制中起著重要的作用[2]，而近年來研究發現，其他輔助性T細胞如Th17 細胞及其分泌的細胞因子在以Th2細胞免疫反應占優勢的過敏性炎癥中也發揮了重要作用，調節Th1/Th2細胞平衡[3]。

程序性死亡受體-1(programmed cell death-l，PD-1)是近來發現的B7-CD28 超家族的一員，主要是負性共刺激信號，對T細胞的失活及凋亡狀態進行精細調控，可以直接抑制致病性效應T細胞[4]。有研究表明Th17細胞數量受其表面因子調控，PD-1是其中最重要的負性調控因子之一，PD-1負調節Th17細胞，其在自身免疫性疾病和過敏性疾病中發揮致病作用[5-6]。然而關于Th17細胞表面的PD-1的表達變化在AR中研究甚少。

本研究旨在應用流式細胞術檢測PD-1在Th17細胞表面的表達水平及Th17的細胞比例變化，研究AR中Th17 細胞的變化情況及其表面PD-1表達水平的變化。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取于錦州醫科大學附屬第一醫院就診的過敏性鼻炎患者30例為實驗組，健康者20例為對照組，所選研究對象需符合以下納入和排除標準，簽署知情同意書，并經錦州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會同意備案。

納入標準：(1)AR組：符合中國過敏性鼻炎診治指南(2018年)[7]診斷標準的過敏性鼻炎患者；(2)HC組：不符合上述診斷標準的健康人員。

排除標準：(1)近1個月內患有呼吸道感染性疾病者；(2)近2周內服用過免疫抑制劑、抗組胺藥或糖皮質激素等抗過敏藥物者；(3)患結核、肝炎等傳染性疾病、嚴重的血液系統疾病及其他全身性疾病者。

1.2 主要實驗試劑及儀器

Cell Activation Cocktail(withBrefeldin A)，APC-Cy7 anti-human CD4，Brilliant Violet 421 anti-human IL-17A，Brilliant Violet 510 anti-human CD127(IL-7Ra)，PE anti-human CD279(PD-1)，PE Mouse IgG1 κisotype Ctrl，APC Mouse IgG1 κ isotype Ctrl以上試劑均購自美國Biolegend有限公司。FACS Verse(3-laser,8color)流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 密度梯度離心法分離PBMC：患者和健康對照者均抽取2 mL EDTA抗凝外周血，混勻抗凝。將外周靜脈血應用密度梯度離心法提取單個核細胞(PBMC),對PBMC進行臺盼藍染色和細胞計數。

1.3.2 PD-1標記的Th17細胞(CD4+IL-17A+)的熒光抗體染色：標記流式管，加入PBMC懸液100 μL，各流式管分別加入3 μL Fc Receptor Blocking Solution，室溫避光孵育15 min。管中以2 μL/mL分別計算加入細胞刺激劑Cell Activation Cocktail(with Brefeldin A)，于37 ℃，5% CO2環境孵育5 h。孵育結束后，取出各流式管，分別加入APC-Cy7-anti-humanCD4，PE-anti-human PD-1各5 μL，輕彈管壁混勻，室溫避光孵育15 min。孵育結束后加入1 mL 1×PBS重懸細胞，室溫1400 rpm×5 min洗滌1次，棄上清液。分別加入200 μL 1×Cytofix/Cytoperm，4 ℃ 孵育20 min。結束后加入1 mL Perm/Wash重懸細胞，室溫3000 rpm ×5 min洗滌1次，棄上清。加入BV421-anti-human IL-17A 抗體，4 ℃避光30 min。結束后加入1 mL 1×PBS，室溫1400 rpm×5 min洗滌1次，棄上清液。流式細胞儀檢測。

四色標記樣本檢測之前，需設置空白對照、各熒光抗體單標對照組和同型對照，對照組包括：(1)空白對照：不加任何熒光抗體；(2)APC-Cy7-anti-humanCD4單標：只加入 APC-Cy7-anti-humanCD4 熒光抗體；(3)BV421-anti-human IL-17A單標：只加入BV421-anti-human IL-17A 熒光抗體；(4)PE-anti-human PD-1 單標：只加入 PE-anti-human PD-1 熒光抗體；(5)同型對照：PD-1的同型抗體PE Mouse IgG1 κ isotype Ctrl，余抗體正常添加(所有對照組樣本按照四色標記樣本操作流程依次進行)。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 AR組與HC組的臨床資料比較

AR組中男性為12例，女性為18例；HC組中男性為8例，女性為12例，年齡均在15～68歲，兩組在年齡及性別方面的比較，均無統計學差異(P>0.05)，結果見表1。

表1 AR組和HC組的臨床資料比較

2.2 AR組與HC組外周血中Th17細胞的比例變化

采用流式細胞技術檢測 AR組和HC組外周血中Th17細胞數量百分比。AR組 Th17(CD4+IL-17A+)細胞百分比(中位值M=2.51%)較 HC 組(中位值M=1.13%)升高(P<0.001，圖1)。

·為數據離群值

2.3 PD-1在AR組和HC組外周血Th17細胞表面的表達

采用流式細胞技術檢測 AR組和HC組外周血中Th17細胞表面PD-1的表達水平，與HC健康對照組相比，AR患者中Th17細胞表面PD-1表達降低(Z=-5.941，P<0.05)，差異具有統計學意義。典型流式細胞儀檢測結果見圖2、圖3、表2。

表2 HC組與AR組實驗數據比較匯總表

流式細胞技術檢測CD4+ IL-17A+ T 細胞占 CD4+ T細胞的百分比，PD-1+的CD4 + IL-17A + Th17 細胞分別占 CD4 +IL-17A +Th17細胞總數的百分比；A：P1 門內包含所有的外周血淋巴細胞；B：P2門內包含所有的CD4+T細 胞；C(HC組)和D(AR組)：P3門內包含所有的Th17(CD4+ IL-17A+)細胞；E(HC組)：為PD-1+ Th17(CD4+ IL-17A+)細胞占Th17(CD4+ IL-17A+)細胞的百分比；F(AR組)：PD-1+Th17(CD4+ IL-17A+)細胞占 Th17(CD4+ IL-17A+)細胞的百分比

圖3 PD-1在Th17細胞表達水平的比較

2.4 在AR組中進行PD-1與Th17細胞的Sperman相關性分析

AR患者中PD-1與Th17(圖4，r=-0.623，P<0.001)細胞比例呈負相關。

圖4 PD-1與Th17細胞百分比的相關散點圖

3 討 論

過敏性鼻炎被認為是各種炎癥介質、細胞因子、趨化因子、神經肽，以及粘附分子和細胞等形成的一個復雜的網絡共同體，而引起的特異性、非特異性的鼻黏膜高反應的變應性疾病。經典研究認為Th1和Th2細胞應答的免疫失衡是變應性氣道炎癥的發病機理的中心[8]。新近發現的Th17細胞是區別于Th1和Th2 細胞的不同亞型，在過敏及自身免疫性疾病的免疫失衡中發揮重大作用。有研究發現過度增加的Th17細胞數目或Th17功能過度活化將激發變應性疾病(包含過敏性鼻炎和哮喘)的發生與發展[9]，我們的研究結果也證明在Th17細胞在AR發病機制中有著至關重要的作用，進一步觀察了Th17細胞表面的PD-1在AR患者外周血中的表達變化，為闡明AR患者Th17細胞免疫失衡的調控因子提供了實驗依據。

AR實驗組中Th17細胞比例增加和過度活化。既往研究表明，Th17細胞是具有優先合成IL-17家族細胞因子(尤其是IL-7A和IL-17E)的新型CD4+T亞型，它們被認為在炎性疾病的發病機理中起著至關重要的作用[10-11]。Liu Y等人的研究結果表明在卵清蛋白或屋塵螨誘導的AR鼠模型的鼻灌洗液中，發現IL-17A水平和Th17細胞頻率升高[12]。這些發現表明Th17細胞免疫失衡與AR發病機制密切相關。

本研究證實在AR中Th17細胞數量增加，其表面PD-1表達降低，PD-1表達水平與Th17細胞數量呈負相關，PD-1為負性調節因子，可促進細胞凋亡，對免疫耐受系統進行精細調控。Th17細胞上PD-1表達水平下降，可導致PD-1對Th17細胞增殖的抑制作用減弱，即Th17細胞增殖能力增加，導致其分泌的細胞因子產生變化，引起免疫功能失衡[13]。因此，在AR中，存在Th17細胞免疫失衡以及PD-1表達異常。

本實驗結果提示AR患者外周血中PD-1 在Th17 細胞表面的表達水平明顯減少。而這一研究結果同L Yang研究的自身免疫性關節炎結果相似，其研究還觀察到PD-1與配體結合后，通過抑制PI3K/AKT通路的活性抑制Th17的免疫應答功能[14]。McAlees[15]對哮喘小鼠模型的研究中，在阻斷PD-1后，可以增加Th17細胞的免疫應答反應，從而增加了動物模型的氣道高反應性。在過敏性哮喘中發現Th1、Th17分化主要由mTORC1支持，T細胞的活化遵循經典的mTOR途徑并且依賴PI3K/AKT路徑，因此，PD-1可能通過直接抑制mTORC1而影響Th17細胞的分化[16-17]。

我們推測Th17細胞表面的PD-1作為共刺激因子參與AR的發病機制，但是其具體作用機制還不甚清楚，仍需做進一步探究。