經圓窗徑路導入正庚醇建立老年性聾模型的實驗研究

李里，史素楠，趙俊玲，宮亮

(1.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院風濕免疫科；2.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，遼寧 錦州 121000)

耳聾是常見病，它可以影響人類交流。我國的耳聾發(fā)病人數位于主要致殘疾病之首，發(fā)病人口超過2000萬，感音神經性聾是耳聾發(fā)病主要原因。由于耳蝸毛細胞在哺乳動物不可再生，故耳聾尚且沒有好的治療方式。佩戴助聽器電子人工耳蝸植入是目前主要的有限的治療方式，而這兩種方式的治療價格較貴，大眾難以接受。這些都影響了耳聾患者的治療和聽力改善。尤其是老年性聾，其可以導致交流障礙、社會孤立狀態(tài)、勞動能力下降，這些都會造成社會巨大的負擔。

老年性聾又稱年齡相關性聽力損失，是由于耳蝸結構和中樞聽覺傳導通路的進行性退化而導致的一種與年齡相關的漸進性雙耳聽力和言語辨別能力下降[1]。世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計結果表明老年性耳聾居老年人聽力減退原因之首[2]。隨著人口老齡化的加速，老年性聾發(fā)病率逐年上升，然而目前關于老年性聾的病理機制尚不完全清楚[3-4]。小鼠是最早被應用于進化、發(fā)育、疾病等遺傳學方面研究的動物模型。小鼠內耳的結構和功能與人類內耳結構和功能十分相似,因此對小鼠耳聾的研究可為人類耳聾的發(fā)病機制提供參考[5]。本實驗擬將正庚醇通過耳后圓窗徑路緩慢導入小鼠的內耳，旨在建立一種快速安全的老年性耳聾模型。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SmartEP&OAE聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)(美國IHS公司)、手術顯微鏡(德國Leica公司)、98%正庚醇(上海麥克林生化科技有限公司)、磨鉆、腦電定位儀。

1.2 實驗動物

健康且聽力正常的4周齡C57BL/6Cnc小鼠30只，雄性，16～20 g(由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供)，隨機分成兩組，對照組：15只，經耳后圓窗徑路緩慢導入0.9%氯化鈉注射液5 μL;實驗組：15只，經耳后圓窗徑路緩慢導入正庚醇5 μL。

1.3 實驗方法

1.3.1 手術操作：腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和噻拉嗪(10 mg/kg)麻醉小鼠后，取左耳朝上側臥位，左側耳周備皮、消毒、鋪無菌紗布，手術顯微鏡低倍鏡下沿術耳耳根部下方2 mm處橫行切開皮膚及皮下組織，切口長約1～1.5 cm，鈍性分離軟組織，自制牽開器牽開術區(qū)，暴露面神經和胸鎖乳突肌，將胸鎖乳突肌向尾側分離暴露聽泡，高倍鏡下分離聽泡后壁軟組織，用磨鉆于聽泡尾側上方鉆開骨壁，鉆孔直徑約0.5 mm，暴露鐙骨動脈及圓窗[6]。腦電定位儀固定改裝的5 μL微量注射器，通過鉆孔將5 μL液體緩慢注入聽泡內，全層對位縫合軟組織及皮膚。手術過程中注意保持圓窗膜的完整性。術后37 ℃恒溫墊復蘇。所有實驗動物均以左耳為術耳，右耳為自身對照耳。

1.3.2 聽性腦干誘發(fā)電位(ABR)測試：分別于術前3天、術后2小時、術后1天、術后3天行ABR檢測。所有小鼠術前ABR閾值≤25 dB SPL作為納入標準。術后3 d內各頻率ABR閾移≥20 dB SPL作為造模成功的標準。各頻率ABR閾值取平均值即為ABR平均閾值。

全身麻醉后，小鼠俯臥于隔音室測試臺上，電極正極置于顱頂正中皮下,負極連接被測耳,接地電極連接對側耳。SmartEP&OAE聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)給予短純音(tone burst)刺激,刺激聲經插入式耳塞給入，選取12 kHz、32 kHz 2個頻率分別進行測試并記錄ABR閾值。重復率39.1 beats/s,帶通濾波100～3000 Hz,疊加1024次,掃描時程16.0 ms[7]。聲刺激強度從80 dB SPL開始,以10 dB逐次遞減,接近聽閾時以5 dB遞減，最后一次出現Ⅰ波并與上一波形有延續(xù)性的聲強數值定為ABR閾值，至少重復3次。同一刺激頻率下給藥前后的聽閾差值記為ABR閾移。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 耳后圓窗徑路導入正庚醇手術

各組小鼠無死亡,實驗組有2只術后3天ABR閾移<20 dB SPL。所有手術小鼠無耳道流膿、紅腫等感染跡象，無歪頭、行走不穩(wěn)等前庭功能受損表現，見圖1。

A:耳下切口位置；B：尋找聽泡的解剖標志：1.面神經，2.聽泡，3.胸鎖乳突肌；C：鉆口(給藥入口)

2.2 ABR檢查

所有小鼠非手術耳ABR平均閾值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，對照組小鼠術耳手術前后各時間點聽力無明顯改變(P>0.05)，實驗組小鼠術耳手術后ABR平均閾值顯著升高，并隨時間推移呈逐漸增高的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1、圖2。同一時間點實驗組小鼠32 kHz頻率ABR平均閾值高于12 kHz ABR平均閾值，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

表1 各組小鼠術耳ABR平均閾值(dB SPL，n=15)

圖2 實驗組小鼠術耳不同時間點ABR平均聽閾

圖3 實驗組小鼠術耳同一時間點各頻率ABR平均聽閾

3 討 論

隨著人口進入老齡化，老年性聾發(fā)病逐漸增高。在老年人中，感音神經性聾最為常見，是老年人導致耳聾最主要的原因。由于聽力的喪失，老年人在生活中的正常交流受限，長期交流不暢，會造成老年人精神和心理壓力，久而久之導致發(fā)病。老年性聾主要表現為兩側對稱慢性進展的聽力喪失，為感音神經性聾，其中以損傷高頻聽力為主。還有一部分患者主要以言語識別功能下降為主要表現。老年性聾的主要病理分型為感音型、神經型、代謝型或血管型、耳蝸傳導型、中樞型和混合型共六型。目前對于老年性聾的機制研究主要有線粒體突變、氧化應激反應、炎癥、細胞凋亡等多方面。而老年性聾在治療方面，并沒有很大進展，目前主要治療方式為人工耳蝸，人工中耳及助聽器。目前基因靶向治療，干細胞移植等治療也取得一定進展。

老年性聾定義為由于年齡相關性退化而導致的進行性、雙側、對稱性聽力損失[8-9]，其最終發(fā)病機制是多因素共同致病的結果，總體而言，內耳細胞的變性和缺失是老年性聾的主要原因，它包括感覺毛細胞、螺旋神經節(jié)、內耳側壁血管紋及纖維細胞等非感覺細胞[10-13]。

既往認為耳蝸毛細胞變性和缺失是其主要病理類型，近年來越來越多研究表明代謝型聾即血管紋和螺旋韌帶的萎縮以及耳蝸內電位(EP)降低是該疾病發(fā)生的重要因素[14-15]。

人和鼠的聽覺系統(tǒng)相似,小鼠的基因組與人類基因組有很大的同源性,能引起小鼠耳聾的基因可能在人類中也存在類似的基因。所以，國內外被廣泛應用于老年性耳聾研究的實驗動物以小鼠居多，如CBA、C57BL/Cnc、BLAB/c等。據本實驗組了解，目前國內CBA小鼠大多是冷凍胚胎，需胚胎復蘇后慢慢飼養(yǎng)，價錢昂貴，成本巨大。大量文獻報道C57BL/6Cnc小鼠攜帶Ahl基因，具有典型的AHL特征[16]，故本實驗選用C57BL/Cnc小鼠為實驗動物。

據了解，現已經有多種小鼠耳聾模型，如噪聲暴露、耳毒性藥物損傷、電離輻射等，但沒有任何理想的模型可以快速、安全、靶向地對耳蝸造成損傷[10，15]e97389，659-655。我們成功經耳后圓窗徑路向C57BL/6Cnc小鼠內耳導入正庚醇，所有實驗小鼠無感染跡象，無前庭功能受損表現。由于小鼠聽泡和耳蝸體積小，又緊鄰重要血管和神經，手術操作較為困難。本實驗探索到該手術的安全三角區(qū)，即由面神經、頸外靜脈、胸鎖乳突肌三者圍成的倒三角，其次磨鉆鉆孔時動作要輕、穩(wěn)，不僅要避免傷及周圍組織而大量出血，更要避免損傷聽小骨、鼓膜、鐙骨動脈等重要結構，最后選取微量注射器也較為關鍵，本實驗采用自行改裝的微量注射器并通過腦電定位儀可以緩慢、勻速的向聽泡內注入藥物。下一步本實驗將應用該模型進行老年聾相關機制研究。本實驗的方法與Lee JH等[17]不同，主要原因為研究目的不同。Lee JH等通過應用噪音的方式制作耳聾模型，進一步研究外周神經元突出傳導功能。

老年性耳聾的聽力下降一般從高頻開始，逐漸發(fā)展至中低頻，本實驗成功注入正庚醇后ABR結果顯示對照組小鼠術耳手術前后聽力無明顯改變，說明手術并沒有對小鼠聽覺功能產生影響，而實驗組小鼠術耳術后ABR平均閾值顯著升高，并隨時間推移呈逐漸增高的趨勢，證實正庚醇能顯著影響小鼠聽覺功能。分析實驗組小鼠各頻率ABR平均閾值結果不難看出，本實驗小鼠各時間段高頻(32 kHz)聽力下降較低頻(12 kHz)明顯，該結果與前人研究結果一致，且與老年性聽力下降特點相符[18-19]。

綜上所述，本實驗成功建立老年性聾的模型，為后續(xù)研究老年性聾的發(fā)病機制和治療提供研究基礎。另外近年來新興的內耳基因治療在耳聾研究中備受關注[20],通過本手術方法也可以向內耳導入基因治療的藥物，為后續(xù)的目的基因轉入遺傳性聾小鼠內耳實驗奠定研究基礎。