長鏈非編碼RNA BANCR在三陰性乳腺癌中的表達及臨床意義

劉星，藺廣榮

(1.錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121000；2.濱州市人民醫院，山東 濱州 256610)

乳腺癌已經成為全人類最常見的癌癥類型，根據國際癌癥研究機構統計的2020年全球癌癥情況分析，對女性來說，乳腺癌是所有癌癥中發生頻率最高和致死的首要癌癥類型，每年呈遞增趨勢，嚴重威脅人類的身心健康[1]。乳腺癌作為一種異質性高的疾病，根據雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2 extracellular domain，Her-2)和Ki-67表達情況分為不同的分子亞型，包括Luminal A、Luminal B、Her-2擴增型和三陰型。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)占總體乳腺癌發病率10%～20%，侵襲性強，預后差，由于缺乏有效治療靶點，化療是主要的治療手段，近年來免疫治療、PARP抑制劑等的應用一定程度上改善了部分三陰性乳腺癌的預后，但相較于其他亞型預后仍差，三陰型亟待尋求有效靶點、開發新的有效的治療手段。隨著 RNA測序技術和生物信息學的不斷發展和應用，非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)逐漸進入了人們的視野，它們不具備編碼蛋白質的能力，但參與了多種生物學進程。越來越多的ncRNA在乳腺腫瘤發生的不同階段表現出巨大的潛力，影響細胞的死亡、代謝、上皮-間質轉化、轉移和耐藥性。在已知的ncRNA的研究中，長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和微小 RNA(micro RNA，miRNA)被報道的比較多，lncRNA轉錄本長度超過200個核苷酸，在腫瘤中的作用不容小覷，包括在表觀遺傳調控、DNA損傷和細胞周期調控、參與信號轉導和介導激素導致的癌癥等。其中lncRNA BANCR是由BRAF基因發生突變后產生的，693-bp lncRNA，最早是Flockhart等人在黑色素瘤細胞中發現其可促進黑色素瘤細胞轉移。繼而發現BANCR在甲狀腺癌、視網膜母細胞瘤、肺癌、胃癌等多種腫瘤中均有異常表達，且與預后有一定相關性，然而其在乳腺癌中的表達及臨床意義鮮見報道。本研究擬利用實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)技術檢測TNBC癌灶及癌旁組織中BANCR表達水平差異，探討BNACR在TNBC中的表達意義及與患者術后的關系，為TNBC的治療及預后提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2011年1月至2015年12月于錦州醫科大學附屬第一醫院行乳腺癌手術切除并經病理診斷為TNBC的患者總計110例，均為女性，臨床病史資料完整，術前均未經化療、內分泌治療及其它任何抗腫瘤治療。年齡31～72歲，平均年齡(50.5±10.1)歲，<50歲42 例，≥50歲68 例；腫瘤直徑<5 cm 78 例，≥5 cm 32例，淋巴結轉移59例，無轉移 51例；未絕經 62例，已絕經48例；臨床分期Ⅰ+Ⅱ期67例，Ⅲ期43例。手術取材的新鮮冰凍組織標本，置液氮冷卻后送-80 ℃冷凍冰箱保存。本研究經過錦州醫科大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準。所有標本檢測均經患者及其家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及設備

Trizol購自美國Invitrogen公司，LncRNA-BANCR及內參GAPDH引物購于北京鼎國生物公司，RT-PCR試劑盒購自美國Santa公司，PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)

選取患者的腫瘤組織作為研究對象，同時選取相應的瘤旁組織(3 cm以外)作為對照。將組織剪碎后，用Trizol試劑提取組織總RNA，按照試劑盒說明書操作將總RNA逆轉錄成cDNA。實時熒光定量PCR反應體系按照SYBR Green說明書配制。內參基因設置為GAPDH。實時熒光定量PCR擴增條件為：95 ℃預變性3 min，隨后 95 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，共40個循環。每例設2個復孔，取其平均值。引物及探針序列如下：BANCR上游引物正向：5’-ACAGGACTCCATGGCAAACG-3’,下游引物反向：5’-ATGAAGAAAGCCTGGTGCAGT-3’。GAPDH上游引物正向：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’GAPDH下游引物反向：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAA-3’，BANCR相對于GAPDH的表達使用2-△△Ct法計算和標準化。

1.4 隨訪

術后對患者10個月1次的定期隨訪，主要以門診復查或電話隨訪形式進行。總生存(OS)時間定義為患者自確診腫瘤至死亡或者隨訪截止的時間。隨訪截止時間為2019年3月31日，生存期以月為計數單位。隨訪的主要內容包括患者一般臨床資料，有無復發及生存狀態。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 TNBC腫瘤組織及癌旁組織中BANCR的表達

RT-PCR結果顯示，BANCR在TNBC中的表達水平為(2.512±0.857)，在癌旁組織中的表達水平為(1.201±0.721)，在癌組織中的表達水平約是癌旁組織表達水平2倍，差異有統計學意義(t=8.666，P<0.01)，見圖1。

圖1 BANCR在癌旁組織及癌組織中表達水平

2.2 影響TNBC患者BANCR表達的臨床因素

以BANCR表達的中位值為臨界值分成兩組：BANCR高表達組(n=55)和BANCR低表達組(n=55)，TNBC患者BANCR的表達與臨床分期及淋巴結轉移有關(P<0.05)，與患者年齡、腫瘤直徑及絕經狀況無關(P>0.05)，見表1。

表1 三陰性乳腺癌患者BANCR表達的臨床影響因素的分析[n(%)]

2.3 BANCR的表達與TNBC患者預后之間的關系

110例患者均無失訪，通過用Kaplan-Meier繪制生存分析曲線，BANCR高表達組中位生存時間為36個月，低表達組為53個月，經Log-rank檢驗分析比較二者具有差異統計學意義(P=0.021)，見圖2。

圖2 BANCR高表達組和低表達組患者術后總生存曲線比較

2.4 BANCR的表達水平與臨床病理參數的單因素及多因素分析

為了探討臨床病理參數影響預后的危險因素，首先將之前統計的各患者臨床病理參數與生存率進行單因素分析，然后將單因素分析結果中有統計學意義的指標進行多因素Cox分析，結果顯示，有淋巴結轉移、TNM分期及BANCR高表達是影響患者術后的獨立危險因素，見表2。

表2 三陰性乳腺癌患者不同臨床病理參數與生存率的單變量和多變量分析

3 討 論

乳腺癌治療目前已經進入分子分型時代，部分亞型已經找到有效治療靶點，三陰性乳腺癌被認為是一種難治性乳腺癌，常常見于絕經前甚至是更年輕的女性，容易較早出現淋巴結轉移和內臟轉移，是高侵襲、早復發的一種乳腺癌分子亞型，因缺乏激素受體的表達和表皮生長因子受體2(Her-2)的表達，長久以來，化療一直是其主要的治療手段。近年來，免疫治療在三陰型乳腺癌的研究如火如荼，Impassion130研究對于PD-L1陽性的患者應用阿替利珠單抗聯合白蛋白紫杉醇中位OS達25個月，也是目前為止在晚期轉移性三陰性乳腺癌總生存最長的研究。但是相較于其他乳腺癌的分子亞型，這個數據顯然并不讓大家滿意。隨著分子生物學技術的發展，通過對通路、基因組學、蛋白組學及代謝組學等研究了解其生物信息，揭示其分子本質，發現更具針對性的、更有效的且毒性更低的診治手段，才能達到真正意義上的精準診治和個體化治療。

近年來，lncRNA成為分子生物學研究的熱點之一，目前已發現多個重要的lncRNA(SNHG12、DANCR、ANRIL)[2-4]參與TNBC的發生與發展，但絕大多數lncRNA在TNBC診斷和治療中的作用機制尚需深入的探索。BANCR定位于9號染色體上q21.11位點，全長693 bp，最初是通過RNA-seq對致癌基因 BRAF 600E表達影響的轉錄物進行篩選而首次被發現[5]。目前已證實在多種實體腫瘤中異常表達。體外細胞試驗中發現，敲除BANCR后顯著抑制了乳腺癌細胞(MCF-7)的增殖、侵襲和轉移能力[6]。He等學者[7]采用RT-PCR、流式細胞儀檢測BANCR在膀胱癌組織中表達顯著下調，其過表達能顯著抑制細胞增殖、侵襲。由此可見，BANCR具有組織特異性。本研究采用RT-PCR技術檢測了BANCR在110例TNBC及癌旁組織中的表達情況，發現BANCR在TNBC中表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。推測BANCR參與了TNBC的發生。研究表明BANCR在食管癌中表達與腫瘤分化、分期及淋巴結轉移有關[8]。在結腸癌中，其表達與淋巴結轉移相關，且是患者預后不良獨立危險因素[9]。本研究通過分析BANCR在TNBC中表達與臨床病理參數的關系，發現BANCR與TNM分期及淋巴轉移相關(P<0.05)，與其它病理參數無關。推測BANCR參與了TNBC的發展。本研究通過用Kaplan-Meier繪制生存分析曲線，BANCR高表達組的中位總生存時間為36個月，低表達組則為53個月，經Log-rank檢驗分析比較二者具有差異統計學意義(P=0.021)。BANCR高表達組患者生存率低，復發率高，預后差，因此，BANCR在三陰性乳腺癌具有臨床預后判斷價值。我們進一步通過單因素及多因素COX分析發現，TNM分期、淋巴結轉移及BANCR高表達是影響患者術后的獨立危險因素(P<0.05)。本研究是首次發現BANCR在三陰性乳腺癌中異常表達并探討其臨床意義。

三陰性乳腺癌基于基因表達譜、蛋白組學等進一步又分為不同的亞型，包括雄激素受體型(LAR)、基底樣型(BLIS)、免疫調節型(IM)和間質型(MES)[10]。隨著轉錄組技術和微陣列技術的進步，我們發現大量的lncRNA與乳腺癌各種亞型之間存在著密切的關系[11]。三陰性乳腺癌不同亞型的lncRNA表達亦存在差異：NR 003221，TCONS 00000027 在間質型(MES)和基底樣型(BLIS)表達高，ENST00000443397主要在免疫調節型(IM)中表達，而ENST00000447908 在雄激素受體型(LAR)中表達增高[12]。在1 0428例乳腺癌患者NGS檢測發現整體人群Braf突變頻率為1.3%，而三陰性亞型突變頻率高達55%。BANCR作為BRAF激活突變后的產物，或是三陰性乳腺癌相較于非三陰型乳腺癌來說相對特異的lncRNA。

綜上所述，BANCR與三陰性乳腺癌的發生發展有關，是三陰性乳腺癌的獨立預后指標，有望成為潛在治療靶點。本研究為后期細胞學和動物模型實驗提供了實驗依據，同時我們也會依托于轉錄組技術及微陣列技術進一步探討在三陰性乳腺癌的不同亞型中BANCR的表達情況，BANCR在三陰性乳腺癌中的促腫瘤具體機制尚待進一步研究證實。