miR-4282對肝癌細胞侵襲、遷移能力的影響

王匯鋒，陳潔，趙咫龍

(1.錦州醫科大學附屬第三醫院普外科，遼寧 錦州 121000；2廣西醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽外科，廣西 南寧 530000)

原發性肝癌(以下簡稱肝癌)是惡性腫瘤中發病率高居前列。2020年有研究統計，在全球多個國家和地區，東亞地區肝癌發病率和死亡率占2018年新發及死亡患者的一半以上，而中國的5年發病率位于日本和美國后居第三[1]。另有統計，在185個國家常見癌癥的統計中，肝癌的發病率居第6位，死亡率居第4位[2]。迄今為止，針對肝癌的診斷和預后評估臨床上仍主要依靠影像學及AFP等腫瘤標志物，因此開發新的標志物逐漸成為肝癌研究的熱點之一。因此，對肝癌分子機制的研究十分重要，可以從機制方向打開對肝癌新的認識，并尋求新的發現。而且，機制研究將為揭示肝癌的發生發展提供依據，并為其診斷、臨床治療及預后評價提供理論依據及選擇支持。

MicroRNA是一類長度為22～28個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們可參與轉錄后基因的表達調控。研究證實miRNA對腫瘤的生長、遷移、分化等功能變化存在一定的影響[3]。因此，對于miRNA的研究有助于揭示腫瘤的發生發展機制，為判斷預后和臨床治療提供依據。針對miRNA和肝癌，一直有相關研究報道，miRNA的異常表達影響肝癌的發生發展[4-5]，并且已有文獻顯示miR-4282與其他腫瘤相關[6-8]，但其與肝癌的關系尚不清楚。因此，本研究主要就miR-4282與肝癌細胞之間的關系進行實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

人肝癌細胞系SMMC-7721(上海生命科學院細胞庫)在完全培養基[DMEM(Gibco)、胎牛血清(Gibco)和青霉素/鏈霉素]，37 ℃，5% CO2中培養。

1.2 方法

1.2.1 瞬時轉染:準備miR mimics和inhibitor(銳博)分別按說明書配置后加入含120 μL Opti-MEM(Gibco)的離心管中混勻，其中mimics取50 nM，inhibitor取100 nM。靜置5 min，加入5 μL LipofectamineTM6000(Lipo6000TMTransfection Reagent; Beyotime)混勻，靜置20 min后將混合液均勻輕柔加入孔板中，再加300 μL Opti-MEM，培養6 h后補足培養基，48 h后收集細胞進行實驗。

1.2.2 實時熒光定量PCR：(1)采用Trizol(Invitrogen)法按說明書操作提取各組細胞的總RNA；(2)miRNA逆轉錄和qRT-PCR分別按照miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(TIANGEN)和miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit(TIANGEN)說明書操作完成；(3)mRNA逆轉錄和qRT-PCR按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TAKARA)和FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(Roche)說明書操作完成；(4)所有qRT-PCR應用STEPONE PLUS(ABI)完成，采用2-△△CT法處理結果。

GRB2：Forward:5’-CTTAGCAAACAGCGGCACGA-3’；Reverse:5’-TACTTCCCGGCTCCATCTCG-3’

β-actin：Forward:5’-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3’；Reverse:5’-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3’

1.2.3 Transwell遷移實驗：上室內加入200 μL DMEM重懸的4×104個細胞，下室加入600 μL完全培養基。培養24 h后擦去上室細胞，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色1 h后拍照計數。

1.2.4 Transwell侵襲實驗：實驗前12 h將Matrigel∶DMEM=1∶8的混合液滴入上室后置于培養箱內。實驗前棄上室液體，用200 μL DMEM重懸5×104個細胞并加入上室，下室加入600 μL完全培養基。培養24 h后擦去上室細胞，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色1 h后拍照計數。

1.2.5 細胞劃痕實驗：準備新孔板并在背面用記號筆劃一道直線，接種細胞后過夜，孔板中細胞飽和度達80%以上視為接種滿意，隨后用無菌槍頭在細胞生長區垂直記號筆劃一直線，加入無血清培養基，48 h后添加5%含血清培養基。分別在0、24、48、72、96 h時間點以孔板背面直線和劃痕相交處拍照，以保證每次拍照于同一視野處。細胞遷移率(MR)，MR(%)=[(L0-SLtime point)/L0]×100%。

1.2.6 3’-UTR熒光素酶報告基因測定：將人GRB2 mRNA 3’-UTR序列克隆到pMIRGLO中制備GRB2 3’-UTR載體，PCR合成GRB2 3’-UTR突變結合位點。根據 LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(Life Technologies)進行轉染，質粒每孔轉染 100 ng，miRNA 每孔轉染100 nM，轉染后48 h按照Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)說明書進行雙熒光素酶檢測，結果取海腎熒光值與螢火蟲熒光值比值。

1.2.7 蛋白提取和Western Blot：收集實驗細胞置于冰上，用RIPA(Biotopped)∶PMSF(Solarbio)=100∶1新制裂解液裂解15 min后，12 000 rpm 4 ℃離心15 min，取上清液即為蛋白并用BCA試劑盒(CWBIO)測蛋白濃度。取各組蛋白應用10% SDS-PAGE分離膠及5% SDS-PAGE濃縮膠進行電泳直至分離膠末端，100 V恒壓轉膜90 min，5%脫脂奶粉封閉120 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育2 h，ECL試劑盒顯色，拍照。GAPDH一抗(Cell Signaling Technology)，Ras一抗(Abcam)。

1.3 統計學方法及生物信息學

2 結 果

2.1 轉染效率驗證

qRT-PCR驗證miR-4282 mimics和inhibitor的轉染情況，mimics表達量(28.326±2.301)高于NC(1.052±0.0854)，t=16.196，P=0.004。inhibitor表達量(0.287±0.037)低于NC(1.075±0.193)，t=27.320，P=0.001，見圖1。

A B C

2.2 miR-4282表達量變化后遷移能力的變化

通過細胞劃痕實驗，結果如表1所示，上調組愈合率增長減慢，下調組愈合率增長迅速，見圖1C、圖2。miR-4282上調后遷移細胞多于對照組[(8±3)vs(30±4),F=46.784，P=0.000]，miR-4282下調后低于對照組[(45±5)vs(31±9),F=11.824，P=0.000]，空白組(30±8)，見圖3。

圖2 細胞劃痕對比圖(照片)

圖3 Transwell遷移實驗對比圖及統計

表1 miR-4282表達量變化后愈合率變化

2.3 miR-4282表達量變化后侵襲能力變化

相較于對照組，miR-4282上調后穿透小室的細胞數目減少[(12±7)vs(24±2)，F=2.602，P=0.000]，而miR-4282下調后穿透到小室外的細胞數明顯增多[(34±8)vs(20±3)，F=14.553，P=0.000]，空白組：(22±6)，見圖4。

圖4 Transwell侵襲實驗結果及統計

2.4 miR-4282互作基因預測

為了尋找與miR-4282相互作用的基因，我們通過TargetScan等多個生物信息學數據庫分析對比對、做韋恩圖、TCGA數據庫中癌癥下調基因相同比對等方法分析篩選后，結果顯示，miR-4282可能與VEGFR、PI3K、GRB2等基因相互作用，通過查詢KEGG PATHWAY網站中的通路圖功能相適應，我們選擇了GRB2這個基因作為驗證與miR-4282的互作基因。

為了探究GRB2可以與哪些基因或蛋白相互作用，我們通過文獻查找和應用STRING網站及KEGG PATHWAY網站進行綜合分析，結果顯示GRB2可通過激活ERBB信號轉導通路影響細胞的侵襲、遷移功能，并影響Ras蛋白的表達。根據目前生物信息學分析結果，我們確定下一步以GRB2基因為研究方向，探究miR-4282如何影響肝癌細胞系SMMC-7721的生物學功能。

2.5 miR-4282表達量變化對GRB2 基因的影響

通過雙熒光素酶檢測證明GRB2-WT+NC和GRB2-WT+MiR-4282組表達量有差異(P<0.05)，miR-4282可影響GRB2基因表達，見圖5A。通過qRT-PCR實驗驗證，我們發現，當miR-4282上調時GRB2基因表達量下調[(0.499±0.150)vs(1.397±0.632),t=4.719,P=0.009],miR-4282下調時GRB2基因表達量上調[(1.726±0.198)vs(0.965±0.129),t=5.179,P=0.035]，見圖5B。

2.6 miR-4282轉染后Ras蛋白表達量的變化

通過對ERBB通路的進一步了解及蛋白互作網絡的分析，我們在通路中選擇了關鍵的Ras蛋白來驗證，探究上調及下調miR-4282是否對Ras蛋白的表達量產生影響。結果顯示，miR-4282上調后Ras蛋白表達量下降[(0.639±0.075)vs(1.164±0.193)，t=3.583，P=0.023]；反之蛋白表達量升高[(1.503±0.187)vs(0.994±0.918)，t=3.45，P=0.026]，見圖5C、5D。

A：雙熒光素酶報告；B：miR-4282表達量變化后GRB2基因的變化；C、D：Western Blot實驗顯示miR-4282表達量變化后Ras蛋白的變化

3 討 論

全世界每年肝癌新發例數超過100萬。而且肝癌患者普遍存在發現晚、預后差，生存期短等特點。因此，尋找一種高特異性及敏感度的生物標志物是肝癌基礎研究的一個方向。miRNA是非編碼RNA中的一種，目前許多研究都發現miRNA在癌細胞中異常表達，并影響癌細胞功能的變化[9-10]，這也促使miRNA的研究變成腫瘤研究的熱點。

目前已有文獻報道發現，miR-4282與結腸癌、乳腺癌、口腔鱗癌相關，其在3種腫瘤細胞系中均存在低表達，且miR-4282低表達可促進3種腫瘤細胞的增殖，并且促進乳腺癌和結腸癌細胞的遷移和侵襲[6-8]197-205，8763-8771，8035-8047。這說明miR-4282在這3種結腸、乳腺及口腔細胞中起抑癌基因作用，腫瘤使miR-4282在細胞中的表達量降低，并促進腫瘤的生長，并且可加速乳腺癌及結腸癌的轉移。根據以上文獻可以推測，miR-4282的低表達預示著結腸癌及乳腺癌預后不良。相關文獻的研究結果與我們的相似，通過前期實驗我們發現，和正常肝細胞相比，miR-4282在肝癌細胞中也處于低表達狀態[11]。

根據體外功能實驗結果，我們得知上調miR-4282可降低SMMC-7721細胞的侵襲、遷移能力，下調可促進侵襲、遷移能力。綜合前期實驗結果，我們推斷miR-4282與其他文獻對其報道的相同，在肝細胞中同樣作為抑癌基因表達并發揮作用。根據生物信息學分析并驗證后，我們發現miR-4282可以影響生長因子受體結合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2，GRB2)的表達。GRB2能夠同時與Shc、Sos結合形成Shc-GRB2-Sos復合物，并將Sos激活，激活的Sos與質膜上的Ras蛋白結合，并將其激活,引起信號級聯反應。目前已有研究顯示，miR-98-5p可通過GRB2抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲[12]；Qizhong Shi等研究顯示MiR-433-3p過表達通過抑制GRB2基因表達來抑制食管鱗狀細胞癌細胞的增殖，遷移和侵襲[13]；Xinjing Wang等研究發現，miR-329通過GRB2/pERK影響胰腺癌細胞的增殖和凋亡能力[14]。以上文獻說明GRB2基因作為腫瘤增殖、侵襲等功能變化的一個重要基因與多種腫瘤相關miRNA的表達相關，這些miRNA的異常表達后通過影響GRB2基因表達從而影響腫瘤的功能變化。進一步實驗顯示，miR-4282也可影響Ras蛋白的表達。通過通路圖及蛋白互作網絡，我們發現GRB2位于ERBB信號轉導通路中，并且GRB2能夠激活Ras蛋白。GRB2基因通過Ras蛋白是一種小G蛋白，Zhou B等發現，突變激活狀態的Ras蛋白是近30%的人類癌癥的關鍵致癌驅動因子，而且Ras蛋白與突變體Ras具有同種型時，野生型Ras蛋白可能充當腫瘤抑制因子，但當Ras蛋白與突變體Ras具有不同種型時，野生型Ras蛋白起著促進腫瘤作用[15]。有研究證實，miR-411-5p下調后通過miR-411-5p-GRB2-Ras途徑促進乳腺癌細胞增殖，遷移和侵襲[16]；Wei-Jiang等發現，miR-1258可通過GRB2/Ras/ERK途徑抑制非小細胞肺癌細胞增殖[17]。我們發現，GRB2-Ras是多種腫瘤發展的一個重要途徑。且調控GRB2表達的上游miRNA和受其調控的下游蛋白均有很多種，但該途徑的主要作用是調控腫瘤細胞的遷移、侵襲能力，GRB2和Ras均位于ERBB通路中，該通路是調控腫瘤侵襲遷移的重要通路。因此我們可以推斷，激活后異常表達的GRB2可能導致多種腫瘤發生侵襲遷移能力的變化，而miR-4282-GRB2-Ras途徑作為影響肝癌侵襲遷移的發現可為臨床治療提供一個新的靶點，即通過阻斷miR-4282的表達影響肝癌細胞的侵襲、遷移，而檢測miR-4282也可成為判斷肝癌預后的一個新的分子標志物。

綜上所述，本研究認為miR-4282通過miR-4282-GRB2-Ras途徑影響肝癌細胞的侵襲、遷移能力。希望能為臨床上提供了一個新的分子標志物，為肝癌的診斷、預后判斷提供新的參考依據。