動物毛發中β-受體激動劑LC-MS/MS檢測方法概論

摘 ? ?要：β-受體激動劑作為食品源動物中的禁用藥，需要被嚴格監督與管控。時隔十年，今年的“315”晚會又爆出“瘦肉精”事件，說明瘦肉精監管形勢依然十分嚴峻。因此，尋求一種易于采集的瘦肉精生物樣本和高效、準確、便捷的檢測方法顯得十分緊迫。動物毛發易于采集，且其中的藥物殘留量高、不易消除、監測窗久，而LC-MS/MS檢測方法提取過程相對簡單，且具有高靈敏度和準確度。基于此，本文對近幾年國內研究的具有代表性的利用LC-MS/MS檢測動物毛發中β-受體激動劑的方法進行了比較和分析，在靈敏度、精密度和準確度方面，LC-MS/MS法都已經達到一定程度的成熟，可以滿足一定的檢測要求。

關鍵詞：β-受體激動劑;獸藥殘留;LC-MS/MS;動物毛發

中圖分類號：S859.84 ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.11.008

Introduction to LC-MS/MS Methods for the Detection of β-Receptor Agonists in Animal Hair

YI Shuping

（Center of Agricultural Products Quality Inspection and Monitoring，Cangzhou Agricultural and Rural Bureau in Hebei Province， Cangzhou， Hebei 061000， China）

Abstract： As the banned drugs in food-derived animals， the β-receptor agonists need to be strictly monitored and controlled. After a lapse of ten years， the 2021 World Consumer Right Day broke out the incident of illegal use of β-receptor agonists， indicating that the supervision situation of β-receptor agonists is still very severe. Therefore， it is urgent to find an efficient， accurate and convenient detection method for β-receptor agonists from an easy-to-collect biological sample. The animal hair is easy to collect， and the monitoring window of drug residue is long because of the high level of drug residue in the hair. Moreover， the extraction process of LC-MS/MS detection method is relatively simple， highly sensitive and accurate. The manuscript compared and analyzed the representative LC-MS/MS methods for the detection of the β-receptor agonists in animal hair in recent years， and the results indicated that LC-MS/MS methods have reached a certain degree of maturity in terms of sensitivity， precision and accuracy， which could meet certain testing requirements.

Key words： β-receptor agonists; residue of veterinary drugs; LC-MS/MS; animal hair

β-受體激動劑，俗稱“瘦肉精”，可用于防治人和動物的支氣管哮喘和痙攣，因能促進動物生長、營養重分配，提高胴體瘦肉率，而被用作食品動物生產環節的促生長添加劑[1]。但過量使用此類藥物會在動物可食性組織中造成獸藥殘留和蓄積，人在大量或長期食用該獸藥殘留的動物組織后，可能會出現肌肉震顫、頭疼、嘔吐等不良反應，對高血壓、心臟病和甲亢等疾病患者的危害極大，嚴重者可致死亡[2]。中華人民共和國農業農村部公告第250號明確將β-興奮劑（β-agonists）類及其鹽、酯列入食品動物中禁止使用的藥品及其它化合物清單[3]。

然而，在實際生產環節，瘦肉精的使用仍屢禁不止。繼2011年“315”晚會上曝光的“健美豬”事件，2021年的“315”晚會又曝光了違禁使用瘦肉精的現象，瘦肉精監管工作面臨嚴峻挑戰。

近年來，針對β-受體激動劑開展的檢測項目和方法很多，但監管的靶標主要以動物可食性組織和尿液為主。但實際上，動物可食性組織的采集需在屠宰之后，具有很大的局限性;且由于檢測的時滯性，即便檢出不合格，對于已流入市場的不合格樣品也難以做到及時有效的管控[4]。尿液的采集非常復雜且對采樣人員要求較高，在收集過程中易對動物造成創傷，嚴重會致動物憋悶死亡。此外，有研究表明，無論是尿液、血液還是可食性組織，在動物停藥一段時間后，由于新陳代謝，獸藥殘留量會低于許多檢測方法的檢出限，致使無法檢出，成為了不法養殖逃避監管的漏洞[5]。

針對監管中的難點、痛點，檢測手段也在不斷與時俱進。有研究表明，β-受體激動劑在被動物攝入后，主要經由尿液排出體外，除了血液，在多種組織器官，如肌肉、內臟、毛發、眼等均有殘留[6]。其中，毛發與其它生物樣本相比，生物結構和生長規律獨特，β-受體激動劑與黑色素存在較高親和力，在毛發形成過程中，β-受體激動劑可能通過與黑色素結合，參與毛纖維的形成，從而與毛纖維緊密結合，不易從毛發中消除，殘留量高，監測窗久[7-9]。且毛發易于采集，對動物無創傷，這些特點使得毛發可以成為一種很好的檢測靶標。

目前，已經報道的關于動物毛發中β-受體激動劑類藥物檢測技術主要有酶聯免疫吸附法（ELISA）、生物傳感器法、高效液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）、氣相色譜質譜法（GC-MS）等[7]。其中，LC-MS/MS法相比于ELISA法、生物傳感器法，其準確度（定性）和靈敏度（定量）都更高。GC-MS法中，由于氣相色譜對目標化合物有低沸點的要求，往往需要在樣品前處理過程中進行復雜的衍生化操作，而LC-MS/MS法相對簡單。因此，本文主要對近幾年國內報道的動物毛發中β-受體激動劑的LC-MS/MS檢測方法進行了比較、分析和總結，旨在為動物毛發中β-受體激動劑在實際檢測分析中提供更多有意義的參考和借鑒，也會在接下來的實際工作中探索進一步優化和簡化檢測方法的可能性。

1 樣品制備方法

因為動物毛發長時間暴露在外部環境中，會接觸到各種各樣的環境污染，因此即使在相對干凈區域采集的樣本，在樣品制備時也要先實施清洗，以盡可能去除外源干擾物[5]。

目前LC-MS/MS檢測法中常用到的洗滌劑有1% SDS（十二烷基磺酸鈉）、1%吐溫-80溶液、甲醇等，最后用水將洗滌劑洗凈，可以配合超聲清洗。洗凈后可以選擇自然風干，或者40～50 °C烘干[10-13]。干燥后剪成適宜長度的小段備用。市面上也有毛發研磨器在售賣，但是對于含油脂成分比較多的毛發，如羊毛等，在實際中研磨效果不是很理想，常常需要配合液氮使用，成本昂貴，操作復雜，不太容易實現大范圍推廣使用。

2 提取方法

因為毛發獨特的生物學結構，β-受體激動劑在被攝入后進入體液，或和血漿蛋白結合，或呈離子狀態，和細胞中的其它組分，如黑色素、蛋白質等相互作用，保留在角質纖維中[14]。若想將藥物從毛發緊湊、堅固的結構中釋放出來，需要通過水解破壞毛發結構。

目前LC-MS/MS檢測方法中用到的水解手段主要有酸水解法、堿水解法以及酶水解法。

2.1 酸水解法

酸水解法條件相對溫和，適用范圍較廣，釋放效率較高。目前用到的水解物有0.1～0.6 mol·L-1鹽酸、0.2 mol·L-1三氟乙酸等，水解條件為47～70 °C消化[15-19]。有研究表明，用酸和甲醇/二硫蘇糖醇的混合溶液，能減少水解時間，提高效率[20]。

蘇曉鷗和沈建忠[10]在其研究中用的0.1 mol·L-1的鹽酸溶液水解。60 °C下溫育過夜，水解時間較長，但酸水解后無需再用其它試劑進行提取或者置換，直接進行凈化處理。

2.2 堿水解法

堿水解法可使毛發完全溶解，藥物釋放完全，但水解條件較激烈，不適合對含不穩定化合物的樣品進行處理。目前使用的水解物主要有0.1～5 mol·L-1氫氧化鈉（在45～100 °C消化10 min～過夜）[21-22]，0.2 mol·L-1氨水或者0.5 mol·L-1氫氧化鉀（60 °C消化）[23-26]。

吳澤君等[11]、張罡等[12]在其研究中皆使用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液水解，80 °C水浴保溫1 h，水解時間較短，但在后續提取中，需要調節pH值，還需用到有機試劑分多次萃取，氮吹后置換溶劑，無論是提取還是凈化，步驟都相對比較繁瑣。

2.3 酶水解法

相較于酸堿水解，酶水解在中性pH下進行，水解條件溫和，對不穩定的化合物適用，專屬性強，適用范圍廣，提取效率高，缺點是價格昂貴。目前已知的水解酶有β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶、蛋白酶K和鏈蛋白酶等[27]。

閔佳玲等[13]在其研究中使用了β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶進行水解。加入乙酸銨緩沖溶液和β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶于37 °C水浴振蕩12 h，水解時間長，但后續提取和凈化步驟較簡單。該方法研究了畜禽毛發樣品中8種β-受體激動劑的痕量分析檢測。

3 定量方法

在色譜分析中，常用的定量方法有校正因子定量、歸一化法、標準加入法、外標法和內標法等[28]。在已發表的關于動物毛發中β-受體激動劑LC-MS/MS檢測方法的文章中，最常用外標法或內標法進行定量分析。

3.1 外標法

用待測組分的純品作為對照物，通過對待測組分與對照物的信號響應值相比較進行定量的方法，稱為外標法，又稱直接比較法[28]。相較于內標法，外標法操作簡單，無需校正因子，適合大批量樣品檢測分析，但結果準確性易受進樣重復性和實驗條件穩定性的影響，易出現分析誤差，對實驗環境、實驗操作、儀器性能等要求較高[29]。

3.2 內標法

選擇樣品中不含的某一種或幾種純物質作為對照物加入待測樣品中，通過對待測組分與對照物的信號響應值進行比較，測定待測組分含量的方法稱為內標法[28]。與外標法最大的不同就是會把對照物，又稱內標物，加到待測樣品中一同前處理，因而內標法能夠在一定程度上消除操作條件的變化而引起的誤差，保證了精密度和準確度[29]。當對樣品情況不了解、樣品的基質很復雜或者不需要測定出樣品中所有組分時，可以采用此方法，但內標物不易找，操作繁瑣，不適合大批量操作。

4 方法比較

β-受體激動劑為食品源動物的禁用藥，因此在實際檢測過程中，方法的靈敏度至關重要。對上述提到的近年來發表的動物毛發中β-受體激動劑LC-MS/MS檢測方法進行歸納比較。結果（表1）可見，不同水解方法，由于提取過程的復雜程度和各種干擾因素，如基質干擾，皆會影響檢測結果的靈敏度和精確度;但隨著檢測技術的不斷完善和發展，方法在更新，從酸水解、堿水解到酶水解，水解物種類越來越多，涉及的β-受體激動劑的檢測參數也在不斷增多;同時內標物的合理使用，使得部分參數的回收率也有所改善和提高。

5 結論與建議

毛發作為監管生產環節違法使用β-受體激動劑的一種靶標，具有眾多優勢：無創傷，易于采集、運輸、貯存，監測窗久等[7-9]。LC-MS/MS檢測方法以其高靈敏度和準確度在眾多檢測方法中脫穎而出。

本文通過對近幾年發表的關于動物毛發中β-受體激動劑LC-MS/MS檢測方法進行分析，對于毛發中β-受體激動劑的檢測，多年來的研究探討表明，LC-MS/MS檢測方法，無論是酸水解、堿水解亦或是酶水解法，在靈敏度、精密度和準確度方面，都已經達到一定程度的成熟，可以滿足一定的檢測要求。

但是也不能忽視，我國目前尚未出臺有關毛發中β-受體激動劑檢測的標準。同時毛發也還不能像尿液、血液一樣實現現場速測，對檢測條件要求較高，不能進行大范圍的普及應用。所以接下來，除了不斷明確和完善有關毛發中藥物進入、蓄積以及內外源干擾因素等理論機制研究，還需要在簡化提取方法、優化檢測方法方面努力，這樣毛發中β-受體激動劑的檢測作為一種對現有其它生物樣本檢測方法的補充，提供更多的用藥信息，對監管生產環節禁用藥的使用、杜絕非法添加具有更加重要的意義。

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收稿日期：2021-07-06

作者簡介：伊淑平（1993—），女，河北滄州人，助理農藝師，主要從事農產品質量安全檢驗檢測方面研究。