右美托咪定對七氟醚麻醉的大鼠下丘腦內(nèi)pCaMKⅡɑ表達(dá)的影響

王叢叢，張巧梅，沈 莉，王海青，馬登明

（1. 山東省蒙陰縣人民醫(yī)院麻醉手術(shù)科，山東 蒙陰 276200 ；2. 陜西省空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，陜西西安 710032）

吸入式麻醉藥自問世以來已有100 多年的臨床使用歷史。七氟烷是目前臨床上常用的一種吸入式麻醉藥。右美托咪定（dexmedetomidine）是一種新研發(fā)的ɑ2 腎上腺素受體激動劑。此藥的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜效果較強(qiáng)，因此在臨床上迅速得到推廣應(yīng)用。右美托咪定對腦的保護(hù)作用在動物的腦缺血/ 再灌注模型中已得到證實(shí)[1]。Ca2+/CaM- 依賴性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin dependent kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ）在真核細(xì)胞中普遍存在，可參與細(xì)胞內(nèi)多種信號的傳導(dǎo)，通過調(diào)控Ca2+對動物的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮一定作用[2]。以往的研究表明，磷酸化的CaMK Ⅱ可參與全身麻醉機(jī)制[3]。在使用七氟醚進(jìn)行麻醉時，右美托咪定能否通過影響磷酸化CaMK Ⅱ而參與全身麻醉機(jī)制仍不能明確[4]。下丘腦是調(diào)節(jié)人體內(nèi)臟活動和內(nèi)分泌活動的高級中樞，能通過多種途徑對機(jī)體活動進(jìn)行調(diào)節(jié)。本文主要是探討右美托咪定對使用七氟醚進(jìn)行麻醉的大鼠下丘腦內(nèi)磷酸化Ca2+/CaM-依賴性蛋白激酶Ⅱα（phosphorylation of Ca2+/calmodulin dependent kinase Ⅱα，pCaMK Ⅱα）表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

20 只雄性SD 大鼠（由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），其體重為250 g 左右。對這些大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守動物倫理學(xué)的相關(guān)規(guī)定。

1.2 材料與儀器

右美托咪定（由江蘇新晨醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)），無菌去離子水溶解，凝膠成像儀（由美國伯樂Bio-Rad 公司生產(chǎn)），氣體濃度檢測儀（由西安諾科儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)），1:2000 的CaMK Ⅱ（由上海信裕生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號為xy-I006081），腦電監(jiān)測儀（由上海海神醫(yī)療電子儀器廠生產(chǎn)），自凝牙托粉和牙托水（由河南牙益美醫(yī)療器械貿(mào)易有限公司生產(chǎn)，批號為180917），大鼠腦立體定位儀（由上海玉研科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽?將濃度為10%的水合氯醛0.5 ml/kg注入大鼠的腹腔內(nèi)，對其進(jìn)行麻醉。采用大鼠腦立體定位儀定位其側(cè)腦室的位置。將2 mL 注射器的針頭打磨成1.7 cm 長的細(xì)管，在大鼠前囟后0.8 mm、腦正中線旁1.2 mm 處對其側(cè)腦室進(jìn)行穿刺，穿刺的深度為3.8 mm。穿刺成功后用自凝牙托粉和自凝牙托水固定細(xì)管。將導(dǎo)電針埋于大鼠的頭皮下，待牙托粉凝固后用膠布固定導(dǎo)電針和細(xì)管[5]。

1.3.2 分組方法及給藥方法 將20 只大鼠隨機(jī)分為對照（control，Con）組和右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）組，每組各有大鼠10 只。經(jīng)Con 組大鼠的側(cè)腦室小管注入無菌生理鹽水0.1 mL，經(jīng)Dex 組大鼠的側(cè)腦室小管注入濃度為20μg/mL 的右美托咪定0.1 mL。將腦電監(jiān)測裝置連在大鼠的頭部，對其實(shí)施全程腦電監(jiān)測。注藥30 min 后將兩組大鼠置于密閉的容器中，用6倍最低肺泡有效濃度（minimum alveolar concentration，MAC）的七氟烷對其進(jìn)行快速麻醉誘導(dǎo)。待其進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，用濃度為1.5% 的七氟烷對其進(jìn)行維持麻醉。麻醉30 min 后停藥，停藥后為其吸入6 L/min 的純氧，對其進(jìn)行快速洗脫處理，直至其完全清醒。

1.3.3 大鼠腦電波的監(jiān)護(hù)和記錄 實(shí)驗(yàn)全程密切監(jiān)測兩組大鼠的腦電波，同時注意觀察其行為變化，選擇七氟烷麻醉30 min 時采集其腦電波進(jìn)行分析。

1.3.4 大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白表達(dá)的測定 在麻醉30 min 時，用斷頭脫頸法快速處死兩組大鼠，取出其腦組織。在冰上快速分離出下丘腦組織，用低溫離心機(jī)對下丘腦組織進(jìn)行離心處理（轉(zhuǎn)速為10 000 rmp/min），保留上清液。以BCA 蛋白試劑為標(biāo)準(zhǔn)品（每例提取標(biāo)本40 μg），求得標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。用聚丙烯酰胺凝膠對上清液進(jìn)行電泳后將其恒壓轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，并用5% 的脫脂奶粉室溫封閉1 h。隨后加入pCaMK Ⅱ一抗，并在3℃下封閉過夜。采用辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗將標(biāo)本在室溫下孵育1 h，顯像后對圖像進(jìn)行分析，明確兩組大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表達(dá)情況[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用One-way ANOVA 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠的腦電記錄及波形分析

用七氟烷麻醉30 min 時，采集兩組大鼠的腦電波進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與Con 組大鼠相比，Dex 組大鼠的抑制性腦電波（δ 波）增多（P＜0.05），興奮性腦電波（α 波、β 波）減少（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 兩組大鼠的腦電波頻譜

2.2 兩組大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表達(dá)情況

用七氟烷麻醉30 min 時，與Con 組大鼠相比，A 組大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表達(dá)量更低（P＜0.05）。與Con 組大鼠、A 組大鼠相比，B 組大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表達(dá)量更低（P＜0.05）。詳見圖2、圖3。

圖2 大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白的相對分子量

圖3 大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 蛋白的相對表達(dá)量

3 討論

吸入式麻醉是指揮發(fā)性麻醉藥物經(jīng)呼吸系統(tǒng)入血，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)而達(dá)到麻醉目的的一種麻醉方法。吸入式麻醉藥在體內(nèi)分解、代謝較少，大部分藥物能以原形從肺部排出體外，具有較高的安全性、可控性[7]。近年來，七氟烷吸入式麻醉在外科手術(shù)中應(yīng)用越來越廣泛[8]。鹽酸右美托咪定是一種高選擇性ɑ2 受體激動劑，能通過激動腦干藍(lán)斑核和脊髓背角的ɑ2 受體而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、催眠的作用。此藥除了具有上述作用外，其在腦保護(hù)、抗炎等方面的作用也逐漸受到人們的關(guān)注[9-10]。生物電現(xiàn)象是生命活動的基本特征之一，各種生物均有電活動的表現(xiàn)。腦電波是腦神經(jīng)細(xì)胞的電生理活動在大腦皮層或頭皮表面的總體反映[11-12]。腦電波中的δ 波是麻醉狀態(tài)下的典型波形，在成人極度疲勞或昏睡狀態(tài)下易產(chǎn)生。腦電波中的α 波、β 波是成人在清醒狀態(tài)下出現(xiàn)的腦電波[13-14]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)側(cè)腦室為大鼠注入右美托咪定后，采用七氟烷對其進(jìn)行麻醉，麻醉30 min 時取其腦電波進(jìn)行頻譜分析，發(fā)現(xiàn)其抑制性腦電波δ 波明顯增加，興奮性腦電波α 波、β 波明顯減少。這一結(jié)果不僅符合右美托咪定的藥理特性，更從電生理學(xué)層面印證了此藥的效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)用七氟烷麻醉30 min 時及動物清醒狀態(tài)下取大鼠的下丘腦組織進(jìn)行免疫印記分析發(fā)現(xiàn)，Dex 組大鼠下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 的表達(dá)量在麻醉30 min時明顯降低，這一指標(biāo)在其完全清醒后逐漸升高并恢復(fù)正常。這一結(jié)果表明右美托咪定能在一定程度上抑制動物腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 的表達(dá)。現(xiàn)階段，全身麻醉技術(shù)已十分成熟，但關(guān)于麻醉藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用機(jī)制的認(rèn)識仍較為局限。近年來，多種參與睡眠覺醒的中樞神經(jīng)遞質(zhì)（如多巴胺、乙酰膽堿、γ- 氨基丁酸等）相繼被證實(shí)參與了麻醉分子機(jī)制[15]。電生理、磁共振等方面的研究也發(fā)現(xiàn)，除了經(jīng)典的大腦皮層、腦干、脊髓外，一些未受重視的中樞結(jié)構(gòu)（如下丘腦）也是麻醉藥的敏感區(qū)域[15-16]。

綜上所述，右美托咪定可對使用七氟醚進(jìn)行麻醉大鼠的腦電波產(chǎn)生抑制，還可抑制麻醉過程中其下丘腦內(nèi)pCaMK Ⅱɑ 的表達(dá)。關(guān)于右美托咪定導(dǎo)致動物意識消失及意識恢復(fù)的機(jī)制，仍需要通過進(jìn)一步的研究來發(fā)現(xiàn)、證實(shí)。