串聯質譜技術在新生兒遺傳代謝病篩查診治中的應用分析

王慶華

（菏澤市婦幼保健院，山東 菏澤274000）

遺傳代謝病(inherited metabolic diseases,IMD)是由于遺傳物質發生改變，導致體內產生異常生化代謝物的一大類疾病，大多數為常染色體隱性遺傳病，臨床表現復雜多樣，缺乏特異性，極易漏診或誤診[1]。新生兒遺傳代謝病篩查是指在新生兒群體中，用快捷、簡便、敏感的檢驗方法，對危害兒童生命、導致兒童體格及智能發育障礙的先天性、遺傳性疾病進行篩查，早期診斷、干預治療，避免患兒機體各器官受到不可逆損害[2]。串聯質譜技術（tandem mass spectrometry,MS/MS）能一次檢測出數十種氨基酸、有機酸、脂肪酸代謝異常，為新生兒IMD的篩查提供了技術支持[1]。2015年5月—2020年12月，菏澤市新生兒疾病篩查中心利用串聯質譜技術篩查266 609名新生兒，確診各類遺傳代謝病236例，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象2015年5月1日—2020年12月31日,利用串聯質譜技術篩查菏澤市各醫院出生的266609例新生兒，均為出生2～20 d，并充分哺乳的新生兒。

1.2 方法

1.2.1血液樣本：根據《新生兒遺傳代謝病篩查血片采集技術規范》，選擇新生兒足跟內、外側緣，按摩采血部位，用75%酒精棉簽輕輕消毒采血部位并拭干，針刺采血部位，無菌棉簽拭去第一滴血，單面輕壓濾紙，血液自然浸透濾紙，連續采集3～4個8 mm直徑大小的血斑，以水平位無污染、懸掛自然晾干，制成干血濾紙片，2～8℃冷藏保存，通過新生兒疾病篩查中心專用冷鏈遞送渠道，5個工作日內遞送至篩查中心篩查實驗室。

1.2.2儀器、材料及試劑 儀器：API3200MD三重四極桿串聯質譜儀(美國ABSCIEX公司)、液氮罐、振蕩器、干血濾紙片手動打孔器、96孔板氮吹儀、96孔板離心機、移液器、電腦及打印機等儀器。材料：96孔聚丙烯板、96孔過濾板、干血濾紙片質控血片。試劑及配置：同位素內標試劑盒（試劑盒常分為2套：A套試劑盒含多種氨基酸同位素內標，B套試劑盒含游離肉堿及?；鈮A的同位素內標），甲醇及乙腈溶液。配置內標母液：分別將裝有氨基酸和酰基肉堿同位素內標粉溶于甲醇溶液，徹底混勻制成內標母液，取內標母液用甲醇稀釋100倍制成內標工作液。配置流動相：用超純水和色譜純乙腈混勻，配成80%乙腈溶液[2]。

1.2.3樣本的檢測流程 采用非衍生化法，取下直徑3 mm干血斑濾紙片，置于96孔過濾板中，加入同位素內標工作液，密封后置于振蕩器約45 min，液體離心移至96孔聚丙烯板中，鋁膜覆蓋，置入串聯質譜儀進樣系統，樣本中的目標物質隨著流動相導入液相色譜分離系統，經過色譜柱、柱溫箱分離后進入質譜真空系統，再經過質譜離子源,液體被霧化、離子化后，質譜質量分析器將離子碎片按質荷比分開，并按質荷比大小先后進入質譜檢測器產生相應的信號得到質譜圖[3]。

1.2.4疾病診斷 根據不同遺傳代謝病發病機制所導致的血中特異性氨基酸或?；鈮A的異常增高或降低，通過分析檢測出的氨基酸、酰基肉堿的濃度及比值的高低，結合尿氣相色譜-質譜分析儀（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）［3］檢測結果，以及輔助檢測血常規、血糖、血氨、甲胎蛋白、肝功能、心肌酶譜和/或基因測序等，可診斷新生兒患有某種相應的IMD。MS/MS檢測結果高度疑似某種IMD者即刻召回進一步確診檢查，并結合臨床表現開始干預治療；對疑似陽性病例，進行再次復篩檢查。

2 結果

篩查、確診各類IMD共14種236例，氨基酸類疾病5種：高苯丙氨酸血癥（HPA）74例，希特林蛋白缺乏癥（CD）11例，酪氨酸血癥3例，同型半胱氨酸血癥（HCY）2例，楓糖尿?。∕SUD）1例；有機酸血癥4種：甲基丙二酸血癥（MMA）106例，3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥（MCCD）12例，異戊酸血癥（IVA）和戊二酸血癥-Ⅰ型（GA-Ⅰ）各1例；脂肪酸氧化障礙性疾病5種：原發性肉堿缺乏癥（PCD）17例，短鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥（SCAD）、中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥（MCAD）、極長鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥（VLCAD）各2例，多種?；o酶A脫氫酶缺乏癥（MADD）2例。

3 討論

IMD是由于細胞內遺傳物質的異常突變導致的有異常生化代謝標志物的一大類先天性疾病，主要有氨基酸、有機酸、脂肪酸等代謝紊亂性疾病。由于代謝缺陷種類、受累臟器、疾病進展程度、生活環境、診斷早晚的不同，患者臨床癥狀各異，病情輕重緩急不等，發病年齡早至胎兒，晚至成年，可致單個臟器或多個臟器損傷，致殘致死率極高，嚴重危害患者生存質量。隨著IMD診斷技術及早期篩查技術的發展，人們對IMD的了解越來越多，IMD從不治之癥已成為可防可治之病，治療效果也越來越好，關鍵是早診斷、早治療、早干預，比如對PKU的早發現、早治療就是很好的范例[1]。

我國新生兒疾病篩查始于1981年，已有40年的歷史，篩查技術由最初的細菌抑制法、酶聯免疫法、熒光法、時間分辨熒光免疫法，發展至今日的串聯質譜技術檢測法，篩查效率也由一次實驗檢測一種疾病發展為今日的一次實驗可檢測數十種疾病，實現了短時間內高效檢測有異常生化代謝標志物的IMD，使新生兒疾病篩查有了飛躍的發展。串聯質譜技術可以檢測出代謝物水平異常。

本研究共篩查266 609名新生兒，確診236例IMD，與歐美資料統計遺傳代謝病在活產嬰兒中總體發病率相近[2],明顯高于國外的發病率，更遠遠高于國內新生兒IMD的發病率［4-8］。其中確診MMA 106例，其發病率約為1/2515，遠遠超出上海新華醫院報道的3/10萬的患病率[1]，為最高單病種發病率。106例MMA中合并型MMA 100例（其中，因患兒出生時即發病且家長治療依從性差，死亡3例；其余97例中包括繼發性MMA 22例），單純型MMA 6例，MCCD 12例。HPA共74例，HPA發病率為1/3603，其中苯丙氨酸羥化酶（PHA）缺乏71例；四氫生物蝶呤（BH4）缺乏3例。HPA為本地區發病率最高的氨基酸代謝性疾病，其次為CD，共11例，發病率為1/24237，遠遠高于上海新華醫院新生兒疾病篩查中心報道1：83000[1]。PCD有17例，為脂肪酸氧化障礙性疾病中常見病，發病率為1/15693。另有TYR、SCAD各3例，HCY、MCAD、VLCAD各2例，MSUD（死亡）、GA-Ⅰ（死亡）、MADD/GA-II（死亡）、IVA各1例，其發病率與國內報道基本相符。

有些疾病在患兒出生1周內就有代謝物水平異常和/或臨床表現，有些患者要在嬰兒、兒童、甚至成人期相關氨基酸或?；鈮A才出現異常，有些患者只在發作期生化指標異常較明顯，而非發作期或無癥狀期可能不明顯。因此，新生兒早期串聯質譜篩查結果正常，并不能完全排除患病的可能[2]。對于遲發或癥狀不典型患者，常規治療無效果時，臨床醫師根據臨床表現要首先考慮MS/MS檢測，以盡早確診或排除IMD，避免致殘致死的情況發生。同時，對經過篩查確診的IMD患兒應制定嚴格的管理隨訪制度，對發病早、病情危重的患兒，通常采取邊檢查確診邊治療干預，以減輕因病而造成的損害；對尚未發病或者癥狀輕微者，也盡早給予干預治療，避免或減少代謝異常產生毒性物質的蓄積，從而避免或減輕IMD患兒不可逆的損害。經治療病情穩定者，定期隨訪檢測MS/MS、GC-MS，并進行生長發育評估等，不斷改善IMD患兒預后。同時對IMD高危家庭進行健康教育，開展產前診斷，預防IMD患兒出生。

綜上所述，應用MS/MS篩查新生兒IMD具有高特異性、高敏性和高效性，為新生兒IMD的篩查和診治提供了可靠的技術支持。