中性粒細胞外誘捕網與血栓性疾病

王鑫，門劍龍（天津醫科大學總醫院精準醫學中心，天津 300052）

中性粒細胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）是一種由顆粒衍生蛋白修飾的DNA支架組成的胞外網狀結構，包含中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、組織蛋白酶G、乳鐵蛋白、五肽釋放酶3、明膠酶、蛋白酶3和肽聚糖結合蛋白等多種活性物質，而細菌、病毒、真菌、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、癌細胞、鈣離子等因素可通過復雜的活化模式誘導中性粒細胞形成NETs［1］。NETs 的抗炎特性與血栓前狀態密切相關，不但可通過為血小板、紅細胞、細胞外囊泡和促凝血因子（如血管性血友病因子）提供支架促進血栓形成［2］，循環中NETs 組分，如無細胞DNA（cell-free DNA，cfDNA）、MPO-DNA復合物、核小體和瓜氨酸化的組蛋白等，還可激活內源性凝血途徑，促進敗血癥、小血管炎、靜脈血栓、冠狀動脈粥樣硬化、缺血性中風以及腫瘤相關血栓的發生和發展（其中組蛋白具有細胞毒性，可造成嚴重組織損傷）［3］。血漿中的NETs相關生物標志物水平在冠心病、缺血性腦卒中［4］和靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE）［5］時發生顯著改變，并與病情嚴重程度、臨床結局顯著相關。本文結合近年來NETs相關基礎和臨床研究文獻，對NETs在血栓性疾病領域的研究進展做一綜述如下。

1 NETs 的形成機制和檢測方法

NETs基本特征是中性粒細胞發生劇烈形態變化的同時釋放疏松的染色質、瓜氨酸化組蛋白和抗菌肽到細胞外空間并形成網絡［2］，此過程稱為“NETs 形成”（NETosis）［6-8］。NETosis主要有3種不同模式［6］，（1）自殺性NETosis，中性粒細胞活化后的NETs形成涉及蛋白激酶C激活、Raf-MEKERK復合物活性增加、肽酰基精氨酸脫亞胺酶（peptidylarginine deiminase，PAD）4活化以及染色質解聚，隨著活性氧促使核膜消失，染色質與細胞質蛋白和顆粒介質混合，最后通過膜孔和細胞膜裂解釋放到細胞外，全過程持續2～4 h；（2）非活性氧依賴的NETosis，中性粒細胞經Toll 樣受體（Tolllike receptors，TLRs）和C3 補體受體刺激活化后，在5～60 min內釋放NETs而不損失核膜或質膜；（3）活性氧依賴的NETosis，中性粒細胞受到C5a 或LPS 刺激的15 min 內，線粒體DNA（而非核DNA）被釋放形成NETs的過程。

可視化檢測NETs的方法主要包括［6-7］：電子顯微鏡（透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡）、熒光顯微鏡、延時視頻顯微鏡（活細胞成像）等。其中，電子顯微鏡是用于表征NETs形成特征的常用工具。但NETs的電子顯微鏡染色特異性低，不足以區分NETs與宿主細胞碎片或炎癥部位存在的其他蛋白質。通過掃描電子顯微鏡（SEM）分析時，使用熒光顯微鏡等其他方法來驗證結果是必不可少的。延時自動共聚焦成像可用于發現線粒體DNA釋放形成NETs，活細胞共聚焦顯微鏡成像技術可以展示染色質擴展的詳細時間過程。

定量檢測NETs 的方法主要包括［7-8］：流式細胞術、ELISA和熒光顯微鏡等。利用高速多光譜成像流式細胞術可評估非線粒體DNA釋放形成NETs。利用ELISA 法可定量檢測人血漿中瓜氨酸化組蛋白3（citrullinated histones 3，CitH3）水平或NETs特異性MPO-DNA和NE-DNA復合物的水平。使用不同的技術、特定和標準化的評估工具通過熒光顯微鏡可對NETs形成進行量化，同時也是將NETosis 與其他細胞死亡機制（如凋亡或壞死）區分開的最可靠方法。

免疫組織化學法可以通過顯色或熒光檢測來評估蛋白質表達。通過測量血液中NETs 成分（cfDNA、組蛋白、MPO和NE）的水平或者利用cfDNA、組蛋白和NE共染色的方法可對血液和組織樣本中的NETs進行檢測［7］。此外，生物阻抗測量可以跟蹤早期中性粒細胞激活，從而可用于監測NETosis的早期階段，有助于刺激依賴性動力學的研究［9］。

2 NETs 與冠心病

NETs的影響貫穿動脈粥樣硬化性疾病的各個階段，與動脈粥樣硬化患者血栓形成存在聯系，其機制可能是誘導內皮細胞凋亡和參與斑塊表面侵蝕，NETs相關生物標志物顯示與動脈粥樣斑塊負荷、冠心病嚴重程度和心血管事件呈正相關［10］，故NETs 逐漸被視為參與心腦血管疾病的重要角色、生物標志物和治療靶點。血小板、中性粒細胞與NETs間涉及復雜的相互激活，同時NETs 還可持續活化內皮細胞、巨噬細胞，進而激活凝血和補體途徑。NETs形成還可通過增強血管壁炎性反應增加單核細胞募集，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成和動脈血栓衍展。NETs和功能受損的內皮細胞間具有雙向作用，與內皮細胞共培養的中性粒細胞會導致內皮損傷［11］，NETs中所含的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）－9可通過激活MMP-2引發內皮功能障礙并減少主動脈內皮細胞依賴性血管舒張，而激活的內皮細胞能依賴趨化因子8 誘導NETs 形成［12］。Ramos-kichik等［11］發現，NETs 對內皮細胞的損害可被脫氧核糖核酸酶1（deoxyribonuclease 1，DNase1）消除，Josefs等［13］的研究發現，清除NETs 可以緩解糖尿病小鼠動脈粥樣硬化的損害，DNase1治療可減輕NETs 誘導的斑塊－巨噬細胞炎癥，促進動脈粥樣硬化的消退。

2.1 NETs作為生物標志物 在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者冠狀動脈中的新鮮血栓栓子和正在溶解的栓子中都可見NETs，但未見于機化栓子中［14］。一項ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）患者冠狀動脈血栓切除研究顯示，血栓NETs負荷與梗死面積呈正相關，與ST段回落呈負相關；與來自相同患者的股動脈樣本相比，經皮冠狀動脈介入治療過程中接受冠狀動脈血栓切除術時從病變部位收集血漿含有更高濃度的NETs 相關生物標志物，并且病變部位的DNase1活性與血栓中NETs負荷和梗死面積呈負相關，重組DNase1能加速體外冠狀動脈血栓溶解［15］。有研究顯示，病變部位的中性粒細胞可通過NETosis 和隨后遞呈組織因子（tissue factor，TF）釋放血栓形成信號［16］，NETs形成與TF血漿水平呈正相關［17］，提示血漿NETs 相關標記物水平，特別是病變部位的測定值可用于推測血栓發生的時長和嚴重程度，有助于臨床選擇治療方案。

NETs相關蛋白已顯示出誘導內皮毒性和增加血栓形成的能力，尤其是循環中NETs相關cfDNA和組蛋白在炎性作用下被NETs釋放，在內皮細胞水平上加劇炎性損害，造成惡性循環。組蛋白已被證明能刺激內皮細胞Weibel-Palade小體釋放血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）［18］，同時NETs形成的纖維蛋白樣基礎可為血小板黏附、活化和聚集提供支撐，進而促進vWF和纖維蛋白原蓄積以及血栓形成。亦有研究認為組蛋白和雙鏈DNA（doublestranded DNA，dsDNA）等標志物的特異性偏低［3］。Langseth等［19］觀察了dsDNA和NETs與STEMI預后的相關性（Spearman相關），結果顯示，dsDNA與白細胞計數（WBC）、肌鈣蛋白T（TnT）、NT-proBNP 和D－二聚體有相關性（r值分別為0.22、0.17、0.10 和0.17），MPO-DNA 與WBC 和TnT有相關性（r值分別為0.18、0.12），CitH3 與WBC 和NT-proBNP有相關性（r值分別為0.09、0.19）；NETs 相關成分水平與PCI期間植入的支架類型、糖蛋白Ⅱb／Ⅲa抑制劑或院前溶栓治療均無相關性；在隨訪期間死亡的76 例患者中，dsDNA水平顯著升高，并與患者的全因死亡率升高相關（P＜0.001），MPO-DNA 或CitH3 與全因死亡率無顯著相關性。Riegger 等［20］多中心研究顯示，NETs 與支架血栓形成的病理生理機制有關，所有支架血栓中都存在炎性細胞，25%的樣本中檢測到細胞外DNA 和NE 的共定位。Demyanets等［21］將外周動脈疾病患者經腹股溝下血管成形術后的CitH3和cfDNA作為NETs形成的標記物，發現循環CitH3和cfDNA可預測支架置入術后缺血結局，并與穩定外周動脈疾病的血小板活化有關。Kluge等［22］的研究顯示，末端補體復合物（terminalcomplementcomplex，TCC）和C5aR1 與MPO-DNA相關，TCC 水平與穩定型冠心病患者的潛在心肌梗死風險相關。上述研究表明，NETs廣泛參與動脈血管炎性損傷、凝血活化和血栓形成，在冠心病和外周動脈疾病患者的病情變化中既是生物標志物也是參與者。

2.2 NETs作為治療靶點 NETs在AMI患者的冠狀動脈血栓中非常豐富，活化血小板可通過高遷移率族蛋白B1與其附近的NETs共同參與促進冠狀動脈血栓形成，NETs 更可作為血小板、紅細胞和纖維蛋白的支架，以促進血栓的延伸和維持栓子穩定。NETs經常出現在形成僅數天的血栓中，但在機化程度更高的冠狀動脈血栓標本中未被發現［14］。NETs結構中的核小體能通過NE降解組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）來促進血栓形成，而抗組蛋白抗體治療可較長時間阻斷氯化鐵動脈損傷模型中的中性粒細胞衍生核小體，其效應可在NE／組織蛋白酶G 雙敲除小鼠中完全逆轉［23］。在小鼠心肌缺血／再灌注損傷模型中，通過注射DNase1靶向阻滯NETs形成過程，可降低損傷部位核小體和CitH3的血漿水平并顯示出對心臟保護的特性［24］。Ge等［25］的研究顯示，DNase1 聯合重組的組織型纖溶酶原激活物（rt-PA）治療可減少大鼠心肌缺血性損傷模型的梗死面積和無血流面積，減輕缺血后左心室重塑，而這些有益效果在單獨使用DNase1或rt-PA治療的大鼠中尚未觀察到。此外，DNase1也顯示出促進溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）誘導NETs產生溶解栓子效應［26］，上述研究表明抗NETs形成藥物可通過抗組蛋白、DNase1單獨或聯合應用等多種模式阻斷NETs對動脈血管的炎性損害過程，對缺血性心臟病產生治療效果。

3 NETs 與缺血性卒中

NETs在腦卒中患者高凝狀態中起著關鍵作用。Kang等［27］的研究顯示，中風導致中性粒細胞在大腦血管募集，進而干擾中風后血管重塑。腦卒中后清除NETs 可促進血管重建，而NETs形成過量或NETs 清除不力對卒中后的血管重建和血管修復產生負面影響。因此，NETs 既是反映卒中風險的生物標志物，也是促進腦卒中患者新生血管形成和功能恢復的關鍵靶點。

3.1 NETs作為生物標志物 核小體、dsDNA和CitH3的血漿水平與缺血性中風患者的卒中嚴重程度和預后相關。Vallés等［4］發現，急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者的核小體、dsDNA 和CitH3 水平顯著高于健康人群，其中特異性較高的CitH3增幅最大，這些NETs標記物的水平與患者入院時的卒中嚴重程度相關（基于NIHSS 量表評分和修正Rankins量表評分）；血中CitH3 和dsDNA 水平在心源性卒中患者更高，其原因可能與炎癥高反應相關；在空腹血糖較高的老年患者和既往房顫患者中，CitH3升高且與1年隨訪期內的全因死亡率有獨立相關性。這些結果表明CitH3可能是評估AIS 預后的潛在標志物。在腦缺血過程中，在毛細血管內部和周圍形成NETs 會促進血栓形成，Laridan等［28］的研究顯示，與新鮮血栓相比，陳舊性血栓富含CitH3和NE；Perez-de-puig等［29］發現，從缺血性中風患者腦循環中提取的血栓存在DNA 和CitH3 的支架結構，推測NETs可能促進繼發性微血栓，而這種繼發性血栓形成可導致缺血時間的進一步延長，并使溶栓時間窗變窄。與非心源性血栓相比，心源性腦卒中血栓中NETs 含量更為豐富，在所有栓子中都存在大量NETs，陳舊性血栓中的NETs 比新鮮血栓的含量更高，表現為dsDNA、MPO和瓜氨酸化組蛋白4的三聯共染色陽性，而且血栓切除術耗時和器械通過次數與NETs 表達水平呈正相關［30］。Lim 等［31］的研究顯示，急性冠狀動脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）組和AIS組dsDNA濃度均高于對照組（P＜0.001），在單變量和多元分析中，ACS組的肌鈣蛋白I（TnI）、dsDNA（P值分別為0.046和0.015）和AIS 組的dsDNA 濃度增高（P＝0.002）有統計學意義；在ROC分析中，ACS組TnI和dsDNA的曲線下面積分別為0.878 和0.968，AIS 組的dsDNA 為0.859；研究認為，在ACS和AIS患者中，外周循環中的NETs 水平在最初發病時增加，可作為早期診斷的生物標志物。目前，基于對血栓栓子的共定位染色和血漿濃度研究，缺血性卒中時NETs組分高度表達，初步認為dsDNA和CitH3、CitH3和NE以及dsDNA、MPO和瓜氨酸化組蛋白4 可能是評估血管損傷嚴重程度、病情發展和臨床預后的潛在生物標志物。

3.2 NETs 作為治療靶點 Zhou 等［32］的研究顯示，在頸動脈血栓形成局部有富含磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）的NETs、血小板和血小板衍生微粒的蓄積，激活的血小板與NETs和PS起互補作用，含PS的NETs為血小板衍生微粒和凝血因子沉積提供平臺，從而增加凝血酶和纖維蛋白形成，NETs相關蛋白酶和組蛋白通過誘導PS 暴露和TF表達，對內皮細胞產生強烈細胞毒性作用并增強受損內皮細胞的促血栓能力；DNase1 和PS 抑制劑明顯拮抗上述作用。Pe?a-Martínez等［33］針對溶栓治療時“t-PA 抵抗現象”的研究顯示，注射DNase1 可促進NETs 溶解（非t-PA 所致溶解），使閉塞血管再通，改善光凝性卒中的預后；用氯酰胺預防性治療可阻止NETs 形成，避免血栓閉塞。由于NETs在頸動脈病變部位造成的損傷與多種因素有關，并可能通過阻止NETs形成的方法進行治療，預期將有更多相關研究聚焦于抑制NETs形成的方法以降低NETs形成帶來的負面影響。

4 NETs 與靜脈血栓

循環中的NETs 相關生物標志物水平與靜脈血栓性疾病的嚴重程度相關，但NETs并不是這些生物標志物的唯一來源，目前尚不清楚是否能反映這些患者中的NETs形成。

4.1 NETs促進VTE的機制 NETs的關鍵成分在靜脈血管內產生促凝作用。在靜脈血栓形成時，中性粒細胞主要通過vWF、TF和黏附分子介導途徑在活化的內皮細胞表面募集，構成了疾病早期階段血栓結構中炎性細胞的大部分。Brill等［34］的研究顯示，組蛋白輸注導致vWF 釋放，并在下腔靜脈狹窄模型中發現可加速深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）；來自大鼠下腔靜脈狹窄模型顯示，血栓結構主要以vWF 相關的NETs 存在為特征，尤其是在早期，NETs通過組蛋白A1結構域與vWF產生相互作用，同時也結合其他與血栓形成相關的蛋白，如纖維連接蛋白（含有能與DNA結合的結構域）［35］。此外，TF在靜脈血栓形成中與NETs關系密切，在NETs生成過程中，中性粒細胞同時產生TF和NE以增加TF活性（NE在TFPI的裂解過程中至關重要），當血小板和中性粒細胞被促凝因子激活后，中性粒細胞產生的NETs成為捕捉血栓基本成分（如紅細胞、白細胞、血小板和激活的凝血因子）的網絡和框架。

Li等［26］研究顯示，在急性肺動脈栓塞患者中，NETs 和LPA顯著升高，LPA通過PAD4依賴性途徑誘導NETs的快速釋放，并誘導NETs 產生有抗t-PA 特性的血栓。同時，LPA誘導的NETs可以激活血小板釋放LPA，從而產生正反饋機制（LPA信號誘導NETs釋放），因此LPA-NETs信號通路可能是VTE防治的新靶點。

Savchenko等［36］研究發現，來源于手術或尸檢組織樣本的免疫組化分析顯示，NETs主要存在于VTE正在機化的區域，而在完全機化的血栓局部則很少出現NETs；表明隨著中性粒細胞進入血栓，NETs形成可能是短暫的，并且隨著血栓逐漸機化，細胞外NETs開始降解并被膠原網絡所取代。由于NETs可以刺激纖維化重塑并促進血栓穩定，而這種血栓很難被內源性纖溶系統降解，故與VTE 的后遺癥密切相關（如血栓后綜合征或慢性血栓栓塞性肺動脈高壓）。

4.2 NETs作為VTE標志物 有研究顯示［34］，與野生型小鼠相比，PAD4 -／-小鼠進一步證實了NETs 形成在靜脈血栓形成中的作用，NETs缺乏導致下腔靜脈狹窄后血栓減少，補充DNase1也顯示出類似的效果。van Montfoort 等［37］發現，DVT患者循環血液中核小體和彈性蛋白酶－α1－抗胰蛋白酶復合物的水平高于非DVT 患者；Diaz 等［38］研究顯示，DVT患者血漿高DNA濃度與D－二聚體、Wells評分和MPO有相關性。

4.3 活動性腫瘤相關VTE 腫瘤細胞、腫瘤誘導活化的血小板、腫瘤或宿主分泌的細胞因子（如粒細胞集落刺激因子和白細胞介素－8）［39］均可對中性粒細胞產生促NETs 形成的效應。

NETs可誘導血小板活化，活化的血小板可通過造血調控和誘導免疫細胞向腫瘤部位遷移，形成腫瘤相關炎性微環境，進而增加DVT風險。血小板TLR4可以觸發NETs形成，血小板P－選擇素也可通過其糖蛋白配體－1激活中性粒細胞形成NETs［40］，而中性粒細胞在該過程中釋放的組蛋白3和4 可依次激活循環中的血小板，NETs 中的cfDNA 不但能直接激活血小板，還可激活凝血因子Ⅻ，放大凝血效應，促進纖維蛋白沉積，為血栓形成提供了強刺激和支架結構。近年研究發現，腫瘤相關細胞外囊泡與中性粒細胞共孵育可促進NETs形成，并可黏附于NETs 復合物［41］，表明腫瘤相關細胞外囊泡與中性粒細胞之間的相互作用可能是增加腫瘤相關血栓風險的重要原因。

腫瘤細胞可直接誘導NETs的形成，在轉移過程中借助NETs保護其免受循環血流剪切應力和免疫系統的影響，進而促進腫瘤生長、血管生成和轉移［42］。中性粒細胞在形成NETs的同時，還促進細胞因子分泌，提供各種與腫瘤發展相關的物質，其中NE可刺激腫瘤生長和傳播［43］，白細胞介素－8直接刺激血管生成［44］，同時來自于細胞外基質的VEGF 可通過MMP-9對血管生成產生正反饋效應［3］。Hisada 等［45］證實，注射DNase1 顯著降低腫瘤小鼠的血栓重量，但不影響對照小鼠的血栓重量；Leal 等［41］發現，DNase1 應用于腫瘤小鼠和對照小鼠可完全消除動脈血栓形成，并降低腫瘤小鼠的VTE負荷，但不影響對照小鼠的靜脈血栓形成。大量研究表明，NETs與TF、vWF 和纖維蛋白結合形成的網絡為癌細胞轉移擴散提供支架結構，DNase1可阻滯此過程，從而為腫瘤相關VTE的防治提供新的靶點和治療思路。

5 展望

在檢測領域，由于NETs 異質性強，其表達受多種病理生理因素的影響，使得現階段的檢測方法都存在局限性（尤其是特異性），因此基于免疫組化技術、流式技術、化學發光技術、免疫熒光技術開發多種類型的生物標志物，并圍繞疾病發展、器官損傷以及血栓相關終點事件進行隊列研究，篩選具有針對性的NETs檢測指標，將有助于臨床從表觀遺傳學視角更為準確審視血栓發生發展的病理機制，為臨床干預提供依據。

在治療領域，目前研究顯示，除DNase1、乙酰半胱氨酸、維生素D和氯喹外，靶向B細胞藥物（利妥昔單抗）、補體系統和潛在IFN-α的單克隆抗體均可能抑制NETs形成過程，因此靶向預防NETs 形成可能在未來成為防治血栓的新方法。但需注意的是，抑制NETs形成有可能會影響機體對細菌的捕獲、殺滅和清除能力。此外，NETs 被破壞之后，其成分（citH3、MPO）擴散到循環中亦有可能加劇全身炎癥反應。因此尚需進行更多的觀察試驗，評估針對NETs及其下游級聯反應采取干預措施的安全性和有效性。