Indian Hedgehog信號通路在軟骨細(xì)胞成熟及轉(zhuǎn)分化過程中的調(diào)控作用

王歡博 賀婷 鄭超 盧瑋光 范靜 頡強(qiáng) 楊柳，

【關(guān)鍵字】 Indian Hedgehog信號通路；軟骨內(nèi)成骨；肥大軟骨細(xì)胞；轉(zhuǎn)分化

軟骨內(nèi)成骨是高等脊椎動物骨形成的主要方式，是軟骨組織不斷生長、退化而后被骨組織取代的骨發(fā)生過程。該過程由間充質(zhì)干細(xì)胞凝聚形成軟骨雛形開始，軟骨細(xì)胞不斷增殖、分化和凋亡。軟骨膜的骨祖細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞，與血管組織一起侵入到退化的軟骨基質(zhì)中，分泌大量骨基質(zhì)形成骨小梁等結(jié)構(gòu)［1］。先前的研究認(rèn)為凋亡是肥大軟骨細(xì)胞的最終歸宿［2］，然而近年來人們利用譜系追蹤的研究方法證實了在軟骨內(nèi)成骨過程中肥大軟骨細(xì)胞能夠向成骨細(xì)胞分化，有助于軟骨內(nèi)成骨［3?6］。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的Wnt 信號通路及其下游的IRX3和IRX5分子可以調(diào)控肥大軟骨細(xì)胞的分化方向［7?9］，但是軟骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程的重要意義以及潛在的分子調(diào)控機(jī)制仍未詳盡闡明。

Hedgehog（HH）信號通路在物種間具有高度的保守性，其在胚胎生長發(fā)育、成體干細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用［10?12］。細(xì)胞合成分泌的HH 蛋白能夠啟動HH 信號通路。在哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三種HH 基因：Sonic hedgehog（Shh）、Desert hedgehog（Dhh）和Indian hedgehog（Ihh）。HH信號通路的啟動需要HH蛋白、PTCH 受體、SMO 受體以及下游轉(zhuǎn)錄分子GLI 的參與。兩種跨膜受體PTCH 和SMO 在HH信號通路中完成重要的信號接收和傳導(dǎo)工作。當(dāng)缺乏HH信號時，PTCH 會抑制SMO 的活性，抑制HH 信號通路傳導(dǎo)；當(dāng)HH 信號增強(qiáng)時，HH 與PTCH 的結(jié)合會啟動SMO，SMO被磷酸化進(jìn)而啟動下游通路。

目前，有大量的研究已經(jīng)證實Indian Hedgehog（IHH）信號通路對骨骼生長發(fā)育以及穩(wěn)態(tài)維持具有不可或缺的功能作用［10?11］。IHH能夠直接調(diào)節(jié)生長板軟骨細(xì)胞的增殖，而且其與PTHrP 組成的負(fù)反饋環(huán)路能夠嚴(yán)格調(diào)節(jié)生長板軟骨細(xì)胞的肥大分化過程［13?14］。另外IHH還能夠調(diào)控軟骨膜的骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨過程［15］。但I(xiàn)HH信號通路是否參與軟骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程尚不清楚。

本研究通過構(gòu)建基因修飾小鼠，特異性調(diào)節(jié)肥大軟骨細(xì)胞及其子代細(xì)胞中的IHH 信號通路的活性，探索IHH信號通路對肥大軟骨細(xì)胞分化方向的影響，旨在闡明IHH信號通路在軟骨細(xì)胞成熟以及轉(zhuǎn)分化過程中的調(diào)控作用。

材料與方法

一、實驗動物

Col10a1?Cre小鼠由香港大學(xué)Kathryn S. E.Cheah 教授饋贈［3］；Rosa26?SmoM2小鼠由哈佛大學(xué)Andrew McMahon 教授饋贈［16］；Ihh?floxed小鼠（IhhC/C）由哈佛大學(xué)Beate Lanske 教授饋贈［17］；β?actin Cre小鼠由加州大學(xué)洛杉磯分校Gail Martin 教授饋贈［18］；Ptch1?floxed小鼠（Ptch1C/C）由昆士蘭大學(xué)Brandon Wainwright教授饋贈［19］；Ptch1?LacZ小鼠由斯坦福大學(xué)Matthew P.Scott教授饋贈［20］。

為了探究肥大軟骨細(xì)胞合成的IHH 蛋白對軟骨內(nèi)骨化的影響，我們構(gòu)建了肥大軟骨細(xì)胞特異性Ihh基因敲除小鼠：先由Ihh?floxed小鼠與β?actin Cre小鼠雜交產(chǎn)生β?actin Cre;Ihhnull/+小鼠，再與野生型小鼠雜交獲得Ihhnull/+小鼠，最終與Col10a1Cre/+; IhhC/+小鼠雜交獲得Col10a1Cre/+; Ihhnull/C小鼠（對照組為Col10a1Cre/+;Ihhnull/+小鼠）。為了明確IHH信號通路是否參與肥大軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程，我們構(gòu)建了肥大軟骨細(xì)胞特異性IHH信號通路持續(xù)啟動小鼠：①Col10a1Cre/+;R26SmoM2/M2小鼠（對照組為Col10a1Cre/+小鼠）；②Col10a1Cre/+;Ptch1LacZ/C小鼠，主要敲除了Ptch1基因的3號外顯子序列（Ptch1?E3），由Ptch1?lacZ小鼠與Col10a1Cre/+;Ptch1C/+小鼠雜交最終獲得（對照組為Col10a1Cre/+;Ptch1LacZ/+小鼠）。構(gòu)建方式見圖1。所有小鼠均為SPF級，飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，所有動物實驗操作均嚴(yán)格遵守《空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物福利倫理規(guī)范》。

圖1 基因修飾小鼠構(gòu)建模式圖 a～c：Cre重組酶驅(qū)動Ihh?floxed（a）、Rosa26?SmoM2（b）和Ptch1?floxed（c）等位基因發(fā)生重組；d：Ptch1?lacZ等位基因示意圖

二、主要儀器與試劑

（一）主要儀器

石蠟切片機(jī)（Leica 公司，德國）；純水機(jī)（Milli?pore 公司，美國）；顯微成像系統(tǒng)（Olympus 公司，日本）；Senograph 600T Senix HF X線機(jī)（GE公司，美國）。

（二）主要試劑

SHH 抗體（Santa Cruz 公司，美國）；RNA 酶、DNA酶、蛋白酶K以及TUNEL染色試劑盒來源于瑞士Roche公司；蘇木精、伊紅、阿利新藍(lán)染液、核固紅染液、DAB顯色劑以及檸檬酸鹽抗原修復(fù)液來源于美國Sigma 公司；35S?UTP（Amersham Biosciences 公司，美國）。

三、樣本收集與切片制備

將10 日齡小鼠行安樂死（吸入麻醉后頸椎脫臼）后取脛骨組織，受精15.5天孕鼠行安樂死后取胎鼠脛骨組織。隨后依次進(jìn)行4%多聚甲醛固定、EDTA 脫鈣、梯度酒精脫水、透明及浸蠟包埋等操作，最終制作5 μm石蠟切片備用。

四、組織學(xué)分析

取10日齡Col10a1Cre/+;Ihhnull/C小鼠脛骨組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化后，入1%阿利新藍(lán)染液（pH 2.5）染色30 min，流水沖洗5 min 后，再入0.1%核固紅染液復(fù)染10 min，又經(jīng)流水沖洗1 min 后，依次進(jìn)行梯度酒精脫水、透明、中性樹脂封片。軟骨基質(zhì)中的酸性黏液物質(zhì)能夠與阿利新藍(lán)結(jié)合，呈現(xiàn)亮藍(lán)色。

取受精15.5 天胎鼠（Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/C和Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/+）或10 日齡小鼠（Col10a1Cre/+;R26SmoM2/M2和Col10a1Cre/+）脛骨組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化后，蘇木精染液染色5 min，分化液分化3 min后自來水沖洗，而后入伊紅染液1 min，依次進(jìn)行梯度酒精脫水、透明、中性樹脂封片。

五、原位雜交

（一）探針制備

Ptch1?E3的cDNA 來源于香港大學(xué)Kathryn S.E.Cheah 教授；Ihh的cDNA 來源于哈佛大學(xué)Andrew P.McMahon 教授；Ptch1的cDNA 來源于麻省總醫(yī)院Henry M.Kronenberg 教授；Cre的cDNA 來源于南加州大學(xué)Takahiro Ohyama 教授；Gli1的cDNA 來源于多倫多大學(xué)Chi?chung Hui 教授；Col1a1的cDNA 來源于弗朗西斯·克里克研究所Robin Lovell?Badge 教授。經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化、PCR 擴(kuò)增，同位素35S?UTP標(biāo)記和純化后，分裝保存于-80 ℃冰箱備用。

（二）原位雜交

預(yù)雜交：取受精15.5 天胎鼠（Col10a1Cre/+;Ptch1LacZ/C和Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/+）或10 日齡野生型小鼠脛骨組織石蠟切片行常規(guī)脫蠟復(fù)水后，蛋白酶K消化5 min，再浸入中性多聚甲醛固定液3 min，經(jīng)洗滌后浸入乙酸酐溶液10 min，并洗滌、梯度酒精脫水，最后晾干備用。雜交：用雜交液稀釋探針，覆蓋組織，放入濕盒，在55 ℃孵育16～20 h。雜交后充分洗滌，并脫水晾干，最后進(jìn)行顯影拍照。

六、免疫組化染色

取10日齡野生型小鼠脛骨組織石蠟切片，行常規(guī)脫蠟復(fù)水后，浸入檸檬酸鹽抗原修復(fù)液，煮沸繼續(xù)加熱2 min后自然冷卻，隨后在3%H2O2溶液中浸泡10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，經(jīng)BSA封閉30 min后，一抗4 ℃孵育過夜，復(fù)溫，二抗室溫孵育1h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染及中性樹脂封片。

七、TUNEL染色

取受精15.5 天胎鼠（Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/C和Col10a1Cre/+;Ptch1LacZ/+）脛骨組織石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟復(fù)水后，按照TUNEL 試劑盒說明書進(jìn)行染色操作，最后于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，對比分析肥大軟骨細(xì)胞的凋亡水平。

八、影像學(xué)檢查

將4 周齡Col10a1Cre/+; Ihhnull/C小鼠和Col10a1Cre/+;Ihhnull/+小鼠麻醉并擺好姿勢后，使用Senograph 600T Senix HF X 線機(jī)對小鼠全身進(jìn)行掃描，對比分析小鼠的骨骼發(fā)育狀況。

結(jié) 果

一、IHH信號通路相關(guān)分子的表達(dá)特征

我們用原位雜交和免疫組化的方法檢測野生型小鼠出生后Ihh的表達(dá)特點，結(jié)果（圖2）顯示小鼠10日齡時，Ihh在肥大軟骨細(xì)胞中大量表達(dá)，合成的IHH 蛋白主要分布于細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)。肥大軟骨細(xì)胞不表達(dá)Ptch1和Gli1，而其周圍細(xì)胞，如軟骨-骨交界及骨小梁區(qū)域的部分細(xì)胞則高表達(dá)Ptch1和Gli1。

圖2 10日齡野生型小鼠脛骨生長板區(qū)IHH信號通路相關(guān)分子的表達(dá)特征（HZ：生長板肥大層） a：Ihh的原位雜交結(jié)果；b、c：IHH蛋白的免疫組化結(jié)果，其中c為b中黑色框選區(qū)域的高倍圖；d：Ptch1的原位雜交結(jié)果；e：Gli1的原位雜交結(jié)果

二、抑制肥大軟骨細(xì)胞合成IHH 損害軟骨內(nèi)成骨過程

與對照組小鼠相比，Col10a1Cre/+;Ihhnull/C小鼠在4周齡時呈現(xiàn)明顯的短肢侏儒的表現(xiàn)（圖3 a）。X 線檢查結(jié)果也顯示該小鼠骨骼發(fā)育異常，表現(xiàn)為胸廓狹小、球形頭骨及椎骨發(fā)育異常（圖3 b）。股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端明顯的異常表現(xiàn)提示抑制肥大軟骨細(xì)胞合成IHH蛋白可能損害軟骨內(nèi)骨化過程。

圖3 抑制肥大軟骨細(xì)胞合成IHH 導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常 a：4 周齡Col10a1Cre/+; Ihhnull/C小鼠與對照小鼠（Col10a1Cre/+; Ihhnull/+）的大體形態(tài)觀察；b：4周齡Col10a1Cre/+; Ihhnull/C小鼠與對照小鼠（Col10a1Cre/+; Ihhnull/+）全身X線掃描結(jié)果，箭頭所指黃色圈選區(qū)域顯示小鼠股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端結(jié)構(gòu)

隨后，我們通過阿利新藍(lán)染色對10 日齡Col10a1Cre/+;Ihhnull/C小鼠脛骨近端組織進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)其生長板和骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂。并且在生長板下方出現(xiàn)一混雜著軟骨和骨小梁組織的膨大區(qū)域（圖4）。

圖4 10 日齡Col10a1Cre/+;Ihhnull/C小鼠脛骨組織阿利新藍(lán)染色結(jié)果顯示軟骨內(nèi)成骨異常，黑色框選區(qū)域顯示混雜著軟骨組織與骨小梁組織的膨大區(qū)域

三、IHH 信號通路持續(xù)啟動不影響肥大軟骨細(xì)胞終末分化

為了驗證Col10a1Cre/+;Ptch1LacZ/C小鼠是否構(gòu)建成功，我們在受精15.5天胎鼠脛骨組織中采用原位雜交的方法檢測Cre、Ptch1?E3和Ptch1等基因的表達(dá)水平。兩端肥大區(qū)軟骨之間為晚期肥大軟骨細(xì)胞。CremRNA嚴(yán)格表達(dá)于肥大軟骨細(xì)胞中，證明了基因敲除的特異性（圖5 a、d）。晚期肥大軟骨細(xì)胞截短的Ptch1表達(dá)上調(diào)證明基因敲除成功，IHH信號通路順利啟動（圖5 b、c、e、f）。

圖5 Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/C 小鼠模型的評估（LHZ：晚期肥大軟骨區(qū)，即星號指示區(qū)域），胚胎15.5 天，Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/C 小鼠（a～c）與對照組（Col10a1Cre/+ ; Ptch1LacZ/+ 小鼠）（d～f）脛骨組織的Cre（a、d），Ptch1?E3（b、e）和Ptch1（c、f）的原位雜交結(jié)果

胚胎15.5 天時，Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/C小鼠的脛骨形態(tài)結(jié)構(gòu)與對照組相似（圖6 a、e）。而且與對照組相比，該小鼠的Ihh（preHCs 和HCs 的標(biāo)志物）和Col1a1（成骨細(xì)胞的標(biāo)志物）的表達(dá)特征均未發(fā)生改變（圖6 b、c、f、g）。另外，肥大軟骨細(xì)胞的凋亡水平也未發(fā)生改變（圖6 d、h）。

圖6 IHH 信號通路持續(xù)啟動不影響軟骨細(xì)胞終末分化：受精15.5 天Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/C 胎鼠（a～d）與對照組（Col10a1Cre/+; Ptch1LacZ/+ 胎鼠）（e～h）脛骨組織的HE染色結(jié)果（a、e），Ihh（b、f）和Col1a1（c、g）的原位雜交結(jié)果以及TUNEL染色結(jié)果（d、h）

四、IHH 信號通路持續(xù)啟動導(dǎo)致出生后骨骼發(fā)育異常

雖然肥大軟骨細(xì)胞中IHH 信號通路啟動的小鼠在胚胎15.5天時未出現(xiàn)異常表現(xiàn)，但是我們對出生后的Col10a1Cre/+;R26SmoM2/M2小鼠脛骨進(jìn)行組織學(xué)分析時發(fā)現(xiàn)除骨小梁結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微改變外，骨內(nèi)膜以及皮質(zhì)骨均出現(xiàn)了明顯的發(fā)育異常；與對照組小鼠相比，該小鼠皮質(zhì)骨厚度下降，而且在骨內(nèi)膜上發(fā)現(xiàn)了一些異常聚集的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)相似，體積較大，細(xì)胞核較大，而且排列擁擠、無序，具有腫瘤細(xì)胞的一般特征（圖7）。

圖7 Col10a1Cre/+; R26SmoM2/M2小鼠出生后骨骼發(fā)育異常，10日齡Col10a1Cre/+; R26SmoM2/M2小鼠（a～c）和對照組（Col10a1Cre/+小鼠）（d～f）脛骨組織的HE染色結(jié)果，星號指示小鼠骨小梁（a、d），皮質(zhì)骨（b、e）和骨內(nèi)膜（c、f）的結(jié)構(gòu)，黃色框選區(qū)域為星號指示區(qū)域的高倍圖像

討 論

近年來，軟骨內(nèi)成骨過程中肥大軟骨細(xì)胞的分化方向一直是研究熱點。細(xì)胞譜系追蹤研究已經(jīng)證實肥大軟骨細(xì)胞是成骨細(xì)胞的另一來源并參與骨形成［3，5?6］，逐漸改變了凋亡是肥大軟骨細(xì)胞最終歸宿這一固有認(rèn)識。然而肥大軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程的重要意義與潛在的調(diào)控機(jī)制仍有待闡明。鑒于IHH信號通路在骨軟骨生長發(fā)育中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用，我們推測該通路可能對軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程具有調(diào)控功能。本研究通過構(gòu)建基因修飾小鼠，特異性地調(diào)節(jié)肥大軟骨細(xì)胞及其子代細(xì)胞中的IHH 信號通路的活性，探究IHH信號通路在軟骨細(xì)胞成熟以及轉(zhuǎn)分化過程的調(diào)控作用。

一、肥大軟骨細(xì)胞分泌的IHH 蛋白對軟骨內(nèi)骨化過程具有關(guān)鍵調(diào)控功能

首先我們明確了IHH 信號通路相關(guān)分子在軟骨內(nèi)骨化過程中的表達(dá)特征，IHH 在胚胎早期階段主要由前肥大軟骨細(xì)胞表達(dá)［21］。我們在10 日齡野生型小鼠脛骨生長板區(qū)域觀察到肥大軟骨細(xì)胞也能夠合成分泌IHH 蛋白，但卻不表達(dá)Ptch1和Gli1。Ptch1和Gli1均是IHH信號通路的下游靶基因，能夠顯示該通路的啟動狀態(tài)。這一結(jié)果表明肥大軟骨細(xì)胞不是IHH蛋白的響應(yīng)細(xì)胞，可能不接受IHH信號通路的調(diào)控。然而不可忽視的是，臨近肥大區(qū)軟骨的軟骨-骨交界及骨小梁區(qū)域的部分細(xì)胞高表達(dá)Ptch1和Gli1，因此我們推測肥大軟骨細(xì)胞分泌的IHH蛋白以旁分泌的形式影響周圍細(xì)胞IHH信號通路的活性，從而參與調(diào)控軟骨內(nèi)骨化過程。

隨后，我們構(gòu)建了肥大軟骨細(xì)胞特異性Ihh基因敲除小鼠，以探究肥大軟骨細(xì)胞分泌的IHH蛋白的具體功能。我們觀察到在敲除Ihh基因后，小鼠出現(xiàn)了明顯的骨骼發(fā)育異常，進(jìn)一步證實來源于肥大軟骨細(xì)胞的IHH 蛋白對胚胎晚期以及出生后小鼠的軟骨內(nèi)骨化過程具有關(guān)鍵的調(diào)控功能。

二、IHH 信號通路不參與調(diào)控軟骨細(xì)胞終末分化但對其轉(zhuǎn)分化過程具有重要調(diào)控作用

為探究IHH 信號通路對肥大軟骨細(xì)胞成熟分化的影響，我們構(gòu)建了兩種基因修飾小鼠（Col10a1Cre/+;R26SmoM2/M2小鼠和Col10a1Cre/+;Ptch1LacZ/C小鼠），持續(xù)啟動肥大軟骨細(xì)胞及其子代細(xì)胞中的IHH信號通路。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)在胚胎15.5天時，表達(dá)Col10a1的肥大區(qū)軟骨之間存在著Col10a1表達(dá)顯著下調(diào)、主要表達(dá)Mmp13的一群肥大軟骨細(xì)胞［3］。這群細(xì)胞是肥大軟骨細(xì)胞的終末分化階段，在軟骨內(nèi)骨化過程中能夠進(jìn)一步分化成為成骨細(xì)胞，我們將其定義為晚期肥大軟骨細(xì)胞［3］。結(jié)果顯示，持續(xù)啟動IHH信號通路后胎鼠脛骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、肥大軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的標(biāo)志物以及肥大軟骨細(xì)胞的凋亡水平均未發(fā)生明顯變化。這些結(jié)果再次證實肥大軟骨細(xì)胞不接受IHH 信號通路的調(diào)控，IHH 信號通路不參與調(diào)控軟骨細(xì)胞的終末分化過程。然而出生后小鼠骨小梁、皮質(zhì)骨以及骨內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的顯著異常則表明持續(xù)啟動的IHH 信號通路會影響軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，損害軟骨內(nèi)骨化過程。

三、持續(xù)啟動IHH信號通路促進(jìn)腫瘤形成

當(dāng)肥大軟骨細(xì)胞中的IHH 信號通路持續(xù)啟動時，我們在出生后小鼠脛骨骨內(nèi)膜區(qū)域觀察到一群異常聚集的細(xì)胞，這些細(xì)胞形態(tài)相似，體積較大，細(xì)胞核較大，而且排列擁擠、無序，具有腫瘤細(xì)胞的一般特征。據(jù)此，我們初步推測骨內(nèi)膜上的細(xì)胞團(tuán)可能是腫瘤組織。與之相符的是，IHH 信號通路具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)腫瘤發(fā)生的功能作用。在軟骨內(nèi)骨化過程中，該通路能夠直接促進(jìn)生長板軟骨細(xì)胞不斷增殖從而維持生長板長度［21］。除此之外，IHH 信號通路能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期因子發(fā)揮致癌作用［22?23］。先前的研究表明抑制PTCH1 或者持續(xù)啟動SMO 均會導(dǎo)致與IHH 信號通路相關(guān)的腫瘤發(fā)生過程［24］。因此我們推測骨內(nèi)膜上異常的細(xì)胞團(tuán)是肥大軟骨細(xì)胞的子代細(xì)胞在IHH信號通路持續(xù)刺激下異常增殖的結(jié)果。

骨腫瘤是比較常見的原發(fā)性骨骼病變，其中包括良性腫瘤以及惡性的骨軟骨肉瘤［25?26］。近期，研究人員利用間充質(zhì)干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞特異性基因修飾小鼠對骨腫瘤的細(xì)胞來源進(jìn)行了相應(yīng)的研究。在Prx1+間充質(zhì)干細(xì)胞中敲除Ptch1基因后會導(dǎo)致內(nèi)生軟骨瘤及骨肉瘤的發(fā)生［23］；在Ctsk+間充質(zhì)干細(xì)胞中敲除Ptpn11也會導(dǎo)致內(nèi)生軟骨瘤的發(fā)生［27］；在表達(dá)Col2a1的軟骨細(xì)胞中抑制FGFR3 和LKB1的活性會導(dǎo)致臨近生長板的軟骨腫瘤［28?29］；分別在表達(dá)Osterix和Col1a1的成骨細(xì)胞中沉默p53和Rb基因則會導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生［30?32］。耐人尋味的是，我們的研究也發(fā)現(xiàn)在晚期肥大軟骨細(xì)胞中持續(xù)啟動IHH 信號通路會導(dǎo)致具有腫瘤細(xì)胞特征的細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)。這表明軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程的異常調(diào)控具有一定的病理學(xué)意義，而晚期肥大軟骨細(xì)胞可能是某些骨腫瘤形成的前體細(xì)胞。

綜上所述，IHH 信號通路在軟骨內(nèi)骨化過程中具有不可或缺的功能作用。雖然該通路不參與調(diào)控肥大軟骨細(xì)胞的終末分化，但其在軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程中具有重要的調(diào)控作用。