長鏈非編碼RNA與腫瘤干細胞

肖 楠，李占峰，姚建新，潘志堯，姚志峰，3

1江蘇聯合職業技術學院南京衛生分院醫學技術系，南京 210038 2浙江大學醫學部基礎醫學院生物化學系，杭州 310058 3南京醫科大學第二附屬醫院腫瘤醫學中心放射治療科， 南京 210011

1 長鏈非編碼RNA

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指一類長度大于200個核苷酸，且不具有蛋白質編碼功能的轉錄本。其主要由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉錄，但在其他真核生物中也可通過RNA聚合酶Ⅴ轉錄[1]。成熟的lncRNA可與多種分子相互作用，形成超分子結構，如RNA/RNA、RNA/DNA、RNA/蛋白質、DNA/RNA/蛋白質或DNA/RNA/RNA復合物[2]。一旦轉錄，lncRNA可順式(控制局部基因表達)或反式(控制遠端基因表達)起作用，導致組織特異性基因的沉默或激活[3]。

盡管大量研究表明lncRNA在轉錄、轉錄后和翻譯水平起作用，但大多數lncRNA功能仍然未知。近年來研究發現，細胞質lncRNA在多種分子機制中發揮重要作用，包括mRNA的穩定性和翻譯調節、蛋白質修飾、作為微小RNA前體或作為競爭性內源RNA。一般來說，lncRNA被認為是轉錄的主要調節因子，可重塑染色質，并與阻遏物復合物相互作用以阻斷轉錄起始位點[4]。

2 腫瘤干細胞

一般認為，腫瘤內部含有具有干細胞特征的功能性細胞亞群，這些特殊的細胞成分稱為腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)。CSC的“干性”特性，使得其能夠在未分化的狀態下自我更新，同時保持分化成多種細胞類型的能力。因此，CSC具有無限增殖能力以及高致瘤性、侵襲性和轉移性潛力，且對放、化療具有抗性[5]。越來越多的研究表明，CSC與腫瘤局部復發或遠處轉移有關，因此了解CSC的分子調控機制顯得尤為重要，以便更有針對性地消滅CSC。

CSC最初在急性髓細胞性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)中被鑒定出[6]；隨后，在乳腺癌、結/直腸癌、腦膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌和胃癌等實體瘤[7- 8]中均鑒定出了CSC。然而，目前臨床上尚不能精確檢測腫瘤中CSC的比例，主要通過特定的細胞表面標志物分離CSC[9]。CD44、CD133、OCT- 4、Bmi- 1、ALDH1、ABCG2和KLF4是常見特異性高表達于細胞表面的CSC標志物。

3 長鏈非編碼RNA在腫瘤干細胞中的作用

眾所周知，lncRNA在炎癥、腫瘤等病理過程中差異化表達，既往研究大多集中于編碼基因在腫瘤發生、發展中的作用。近年來研究表明，lncRNA也參與了腫瘤的發生和進展。例如，在CSC亞群中存在特異性lncRNA的異常調控[10]；lncRNA HAND2-AS1可維持非小細胞肺癌細胞的干性[11]；lncRNA ZNF281通過調節核因子-κB1信號通路抑制膠質瘤干細胞的自我更新能力[12]；lncRNA UCA1通過作為Slug的競爭性內源RNA(competitive endogenous RNA, ceRNA)增強膠質瘤細胞的“干性”[13]；lncRNA HAND2-AS1在肝CSC呈高表達，參與了肝CSC自我更新以及肝細胞癌(hepatocellular carcinomas, HCC)的發生；HAND2-AS1將INO80染色質重塑復合物招募至BMPR1A的啟動子上，從而誘導其表達，并導致BMP信號的激活[14]。lncRNA的過表達、缺乏或突變均可能對CSC的自我更新能力產生影響，因此lncRNA在CSC調控中發揮重要作用。

3.1 LnchPVT1

LnchPVT1是一種核lncRNA，在HCC中顯著上調，并與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染有關[15]。最近研究發現，LnchPVT1與肝CSC呈正相關。LnchPVT1受轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)途徑調節，其可在HCC組織中被HBV激活[16]。已有研究證明LnchPVT1可在體外和體內增強肝CSC能力，主要通過穩定核仁蛋白NOP2介導HCC細胞獲得干細胞樣特性[17]。

3.2 Linc00617

Linc00617是染色體14相關的長鏈基因間lncRNA，大小為2937 nt，其在晚期乳腺癌組織及轉移淋巴結中呈高表達，并促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲。Linc00617與乳腺癌CSC的自我更新及擴增有關。由于CSC的部分富集，Linc00617過表達可增加乳腺癌細胞群的乳腺球形成和致瘤能力。體內試驗表明，Linc00617缺乏可能導致轉移性結節數量急劇減少。進一步研究Linc00617調控CSC的分子機制發現，Linc00617是一種與Sox2基因啟動子結合的核lncRNA，并通過招募核內不均一性核糖核蛋白K激活其轉錄。研究顯示，Linc00617和Sox2的表達水平之間存在正相關。Linc00617可能通過調控Sox2表現致癌活性，而Sox2刺激上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)并增強CSC的自我更新能力[18]。

3.3 HIF2PUT

缺氧誘導因子- 2α啟動子上游轉錄物(hypoxia-inducible factor-2α promoter upstream transcript，HIF2PUT)是一種新型lncRNA，在骨肉瘤和結腸癌干細胞中具有關鍵調節功能[19- 21]。 HIF2PUT是位于缺氧誘導因子- 2α(hypoxia-inducible factor- 2α，HIF- 2α)基因的啟動子上游區域的反義lncRNA。 HIF2PUT調節其宿主基因HIF- 2α在骨和結腸組織中的轉錄活性。HIF2PUT過表達導致HIF- 2α表達升高，而缺乏HIF2PUT則導致骨肉瘤和結腸癌衍生細胞系中HIF- 2α表達降低。HIF2PUT和HIF- 2α在侵襲性骨肉瘤中通常表達升高，且HIF2PUT的高表達可預測骨肉瘤患者的不良預后[20]。HIF- 2α與CSC存在相關性，在CSC特性調節中發揮作用。

HIF2PUT在骨肉瘤和結腸癌CSC中發揮不同的調控作用。在骨肉瘤中，HIF2PUT充當CSC自我更新的有效抑制劑。研究發現抑制HIF2PUT可增強CSC的增殖、遷移和自我更新，而其過表達可抑制這些特征[21]。相反，在結腸癌中，HIF2PUT表達與具有CSC表型的細胞群的富集相關，而HIF2PUT缺失則損害CSC特性，包括增殖、自我更新、遷移和侵襲。此外，HIF2PUT的抑制導致CSC標志物(Oct4、Sox2或CD44)減少[19]。總之，這些數據表明該lncRNA可能在源自不同組織類型CSC的調節中發揮相反的作用。不同組織譜系中lncRNA的功能表征對組織特異性治療至關重要。 lncRNA與微環境之間的信號傳遞，例如基質細胞和細胞外組分，可能對腫瘤進展和治療具有較大影響。

3.4 HOTAIR

Hox轉錄本反義基因間RNA(Hox transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR)是一種致癌lncRNA，其在多種腫瘤中的表達存在異常，包括乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、胰腺癌和子宮頸癌[22]。該lncRNA能夠誘導其靶基因的激活或沉默。HOTAIR可募集MLL1甲基轉移酶并誘導賴氨酸4的組蛋白H3三甲基化(histone H3 trimethylation of lysine 4，H3K4me3)，從而使染色質松散。 HOTAIR還可募集梳抑制復合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)，誘導H3K27me3，并最終引發基因沉默[23]。

研究發現，在源自乳腺癌、口腔癌和結腸癌以及神經膠質瘤的CSC中，HOTAIR表達升高[24- 26]。這種lncRNA的表達與干細胞特征的獲得有關，導致腫瘤生長和轉移潛能增強[24,27- 28]。 HOTAIR主要通過以TGF-β依賴的方式觸發EMT誘導腫瘤“干性”的產生[24- 25]。已經發現HOTAIR的外源性表達導致EMT誘導物Zeb1、SNAIL、TWIST和CTNNA1的上調，并誘導間充質標志物，如Vimentin和纖連蛋白(Fibronectin)的產生。相應的，上皮標志物，如E-cadherin、骨成型蛋白7和人類表皮生長因子受體3也被HOTAIR下調。在EMT期間被HOTAIR下調的基因表現出PRC2占據的增加[25]。由HOTAIR誘導的干細胞特征已通過增加的集落形成、遷移和自我更新能力而得到證實[26]。此外有研究表明，HOTAIR可能通過下調SETD2促進CSC生長[27]，還可誘導干細胞標志物(如Sox1、Sox2、Oct4和CD44)的表達[25- 26]。HOTAIR可通過減弱miR- 34a的功能來調節Sox2表達，與晚期臨床腫瘤預后差呈正相關[29]。通過使用抑制CSC增殖、遷移、侵襲和自我更新的HOTAIR抑制劑，可發現lncRNA的治療價值。因此，HOTAIR可作為延緩腫瘤進展和侵襲/轉移的靶點[28,30]。

3.5 Lnc34a

Lnc34a是一種新的lncRNA，其與miR- 34a編碼基因結合并通過將DNA甲基轉移酶3a和組蛋白脫乙酰酶1募集至miR- 34a啟動子以調節其沉默。既往研究表明，miR- 34a可能作為Notch和Wnt信號通路的負調節因子，這對CSC的自我更新至關重要[31- 32]。研究表明Lnc34a在結腸CSC中高表達，可促進CSC自我更新[33]。 Lnc34a是第一個在CSC分裂過程中表現出不對稱分布的lncRNA，因此產生具有不同細胞命運的不對稱子細胞。Lnc34a通過抑制不對稱細胞分裂導致CSC分化，而過表達則通過對稱細胞分裂導致CSC增殖，這種與其他lncRNA調節不對稱CSC分裂的機制仍需進一步研究。miR- 34a-Lnc34a軸的發現讓人們認識到lncRNA在該過程中的重要性以及其協調CSC自我更新過程的潛力。

3.6 H19

H19是位于11p15.5區域的印記基因，僅由母本等位基因表達[34]，是最早發現與腫瘤相關的lncRNA，其在乳腺癌[35]、前列腺癌[36]和膠質母細胞[37]的干細胞樣細胞中過表達。

在乳腺癌中，H19的異位過表達可顯著促進腫瘤細胞遷移、克隆和球形成能力；反之，H19的抑制則會破壞乳腺癌細胞的生長和腫瘤形成能力。H19主要存在于乳腺癌細胞的細胞質中，其與miRNA let- 7結合，從而導致let- 7靶標Lin28的表達增強。 H19也可通過負反饋回路被let- 7抑制。值得注意的是，H19與Lin28在原發性乳腺癌中共表達，且二者對于維持乳腺CSC自我更新起關鍵作用[35]。Lin28還可阻斷成熟的let- 7產生，從而避免H19的負反饋抑制并逆轉H19缺失介導的乳腺CSC特性的抑制[35,38]。這些結果表明H19/let- 7/Lin28形成雙負反饋環以促進乳腺CSC的維持。在前列腺癌中，H19上調干細胞標志物，如與Sox2、Oct4、Notch1、Klf4、c-Myc和Abcg2的表達相關[36]。H19還在膠質母細胞瘤的CSC自我更新中發揮作用[37]。研究發現H19表達主要限于CSC部分，外源性表達導致該部分的遷移以及神經球和腫瘤形成能力增強。H19還作為miR- 138、miR- 200a和miR- 141的ceRNA參與CSC的調節[39- 41]。值得注意的是，H19可干擾miR- 138和miR- 200a表達，從而避免抑制Vimentin、Zeb1和Zeb2，并伴隨誘導EMT。 H19的上調導致EMT涉及多個基因的調節，這可能促進腫瘤干性特征[42]。

3.7 HOTTIP

HOTTIP從HOXA基因座的5’端轉錄，并以順式作用調節HOXA基因的表達。HOTTIP結合接頭蛋白WDR5，并將WDR5/MLL復合物靶向HOXA基因座，導致H3K4me3。HOXA成員在干細胞的多能性、分化和自我更新中起重要作用。

HOTTIP在胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)中過度表達，并促進其進展、侵襲和耐藥。這種lncRNA還可促進EMT并調節胰腺CSC[43]。Fu等[44]發現HOTTIP在胰腺CSC的細胞核中高表達，并通過Wnt /β-連環蛋白(Wnt/β-catenin)途徑增強CSC特性。 HOTTIP在CSC調節中的作用是基于HOXA9的誘導和隨后Wnt途徑的激活。 HOTTIP/HOXA9/Wnt軸通過控制CSC維持和自我更新以提高CSC活性。基于HOTTIP和HOX9的表達可預測PDAC患者的預后，因此可作為PDAC的潛在治療靶點和分子標志物[43,45]。

3.8 MALAT- 1

轉移相關的肺腺癌轉錄物1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT- 1)是高度保守的lncRNA，其在腫瘤中呈過表達并促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[46]。研究表明，MALAT- 1在源自胰腺和乳腺腫瘤的CSC中過表達[47- 48]。MALAT- 1可促進CSC表型分化，并調節其增殖、遷移、集落形成以及自我更新能力[47- 50]。MALAT- 1具有與miR- 200c和miR- 145互補的位點，因此可作為此類miRNA的內源性海綿，導致Sox2表達的上調[47- 48]。MALAT- 1的下調可降低干細胞標志物(如Bmi1、Nanog、Sox2和Nestin)在神經膠質瘤和胰腺癌中的表達[49- 50]。MALAT- 1還可與lncRNA HULC配合，以增加端粒重復結合因子2(telomere repeat-binding factor 2，TRF2)的表達、磷酸化和類泛素化修飾，并加速肝CSC增殖，從而導致肝癌進展。敲除TRF2可抵消MALAT- 1和HULC的致癌功能。MALAT- 1與HULC結合還可增強端粒酶活性并促進TERT和TERC之間的相互作用，從而延長端粒長度，延長肝CSC的壽命[50]。MALAT- 1的這種干性調節作用主要基于Snail、Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的調節導致EMT[51]。

近期Xiao等[52]的研究表明，胃癌組織中MALAT1和Sox2的表達呈正相關，對胃CSC具有正向調節作用。MALAT1作為Sox2的轉錄后關鍵調節因子，可直接與Sox2 mRNA結合，增強了mRNA的穩定性并增加其表達，敲低Sox2則部分逆轉了MALAT1對胃CSC的正向調節作用；此外，該研究還發現MALAT1對放、化療敏感性有負性調節作用。鑒于MALAT1的強大功能，近年來有學者提出MALAT1可作為腫瘤治療的新靶點[53]。

3.9 lncARSR

lncARSR是在舒尼替尼耐藥的腎細胞癌中被激活的lncRNA，可增強舒尼替尼對腎細胞癌的耐藥性[54]。lncARSR通過直接結合miR- 34/miR- 449促進藥物抗性，從而導致AXL/c-Met表達和信號傳導及轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT3)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)和細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號傳導的再激活[54]。lncARSR在腎CSC呈高表達，且參與維持其干細胞表型、促進腎CSC的自我更新、致瘤及轉移。高lncARSR水平可作為腎透明細胞癌患者預后不良的獨立預測因子。lncARSR與Yes相關蛋白(Yes-associa-ted protein，YAP)結合，并通過阻斷YAP與大腫瘤抑制激酶- 1的相互作用促進其核轉位。 YAP在CSC細胞核呈高表達，在Hippo信號傳導中充當轉錄共激活因子，這在CSC擴增中起關鍵作用[55]。

在CD133陽性的肝CSC和富含CSC的肝癌細胞中，lncARSR的表達明顯增強，并可促進肝CSC的擴增。干擾lncARSR則通過抑制肝癌細胞的去分化和降低肝CSC的自我更新能力抑制肝CSC的擴增，并使肝癌細胞對索拉非尼或順鉑更敏感。在肝癌細胞中，STAT3是lncARSR的下游靶基因，抑制STAT3的表達則使肝CSC比例降低，從而證實了lncARSR促進肝CSC增殖過程需要STAT3參與[56]。

3.10 lncTHOR

在肝CSC和富含CSC的肝癌細胞中，lncTHOR的表達明顯增加。干擾lncTHOR可抑制肝癌細胞的去分化，降低肝CSC的自我更新能力，從而抑制肝CSC的擴增。在肝癌細胞中，β-catenin是lncTHOR的下游靶基因。特異性抑制β-catenin則使肝CSC比例降低，進一步證實了β-catenin是lncTHOR促進肝CSC擴增所必需的因子。此外，干擾lncTHOR表達可使肝癌細胞對索拉非尼治療的敏感性更高，提示lncTHOR表達可使低表達的肝癌患者可能受益于索拉非尼治療[57]。

4 腫瘤干細胞相關長鏈非編碼RNA的治療意義

CSC是腫瘤發生、維持、進展、轉移和復發的關鍵參與者。此外，CSC對常規藥物治療具有耐藥性[58]。由于CSC在分子和功能上與一般腫瘤細胞不同，因此可開發治療性替代物以消除可能引起腫瘤進展或復發的CSC。這種選擇性療法具有較少的副作用，且對非CSC表現出較低的毒性。目前研究已充分證明，lncRNA具有誘導CSC自我更新、遷移、侵襲、耐藥和分化的重要能力[59]。且近年來人們對lncRNA在控制細胞分裂、賦予腫瘤耐藥差異性、保護端粒末端、維持基因組結構、與關鍵信號通路相互作用以及調節腫瘤干細胞相關基因的功能等方面進行了深入研究，并取得了較大進展[33,35,59]。

晚期腫瘤的CSC利用對稱分裂策略使子細胞能夠自我更新，從而迅速增加腫瘤內CSC的數量[60]。這一發現表明，控制或避免晚期腫瘤中對稱的CSC分裂可能對臨床有益。由于lncRNA可能在調節CSC不對稱性和對稱性平衡中發揮獨特作用[33]，改變其功能可能會干擾分裂機制。因此，控制CSC分裂方式的lncRNA可被視為治療晚期腫瘤的潛在靶標。

lncRNA也可能參與CSC中耐藥性的獲得和維持。lncRNA可激活幾種機制以促進抗藥性，包括調節藥物轉運蛋白表達水平、調節存活信號傳導途徑、避免細胞凋亡和誘導DNA修復[39]。

5 小結與展望

lncRNA參與包括腫瘤發生、發展在內的諸多病理生理過程，而CSC可以驅動腫瘤的發生和發展。鑒于近年來lncRNA與CSC之間的關系開始受到學界的關注，本文綜述了參與CSC自我更新、維持和分化相關的lncRNA的功能及潛在分子機制。

CSC轉移、逃避常規治療的能力成為腫瘤復發的主要原因。盡管其在腫瘤發展中起著重要作用，但這種細胞亞群的調節機制尚未完全明確，因此需進行更深入的研究。lncRNA可在不同水平以不同方式發揮功能，然而迄今為止，僅少數lncRNA被鑒定為參與CSC的形成，因此需進一步研究lncRNA與CSC形成的關系及內在機制。

lncRNA在人類細胞基因組中高度豐富，參與轉錄、翻譯和翻譯后水平調節多個過程。只有了解lncRNA發揮功能的分子機制并揭示lncRNA在特定組織中發揮的作用，才能為lncRNA作為診斷或預后標志物，甚至作為未來治療的靶標提供基礎。大量研究已經發現關于特定lncRNA在賦予藥物抗性、控制細胞分裂、確定細胞命運和調節干細胞相關基因的轉錄或翻譯方面的功能，且可在血清、唾液、尿液、血液或組織活檢中檢測到lncRNA，毫無疑問，lncRNA正成為未來腫瘤精準治療的有力工具。

作者貢獻：肖楠負責查閱文獻、撰寫初稿；李占峰、姚建新、潘志堯負責核對文獻、提出修改意見；姚志峰負責修訂、審核論文。

利益沖突：無