環狀RNA在多囊卵巢綜合征發生發展中的作用

皇靈俐，馮睿芝，錢云

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡婦女無排卵性不孕的常見病因，在世界范圍內患病率約5%～20%[1]。PCOS是以無排卵或稀發排卵、高雄激素和卵巢多囊樣改變為特征的異質性綜合征，PCOS患者罹患不孕、胰島素抵抗和2型糖尿病、心血管疾病和子宮內膜癌等疾病的風險增加。雖然PCOS的病因仍未完全明確，但研究認為PCOS是多因素致病，其中遺傳因素在其發生發展中起關鍵作用[2]。環狀RNA（circular RNA，circRNA）是由真核生物的前體mRNA反向剪接產生的，具有細胞特異性和組織特異性。circRNA的產生依靠剪接體機制，且受順式作用元件和反式作用因子的調節[3]。隨著RNA測序技術和新型生物信息化方法的發展，最新的一些研究已在卵巢和胎盤等多種組織中檢測并鑒定出了豐富多樣的circRNA[4-5]，相關研究發現差異表達的circRNA在PCOS的發生發展中發揮重要作用[6-7]，這促進了PCOS與circRNA關系的研究。關于circRNA與PCOS發生發展機制的研究仍處于初步階段，現就目前circRNA在PCOS發病中可能的作用進行綜述。

1 circRNA概述

circRNA是通過特殊的選擇性反向剪接方式產生的，即外顯子的3′端通過3′，5′-磷酸二酯鍵與其自身的5′端或上游外顯子連接，形成具有反向剪接連接位點的封閉環[8]。circRNA形成的剪接方式主要有2種：套索模型和直接反向剪接模型[9-10]。在套索模型中，反向剪接的外顯子跳躍形成內含子套索，內含子進一步反向剪接形成circRNA。在直接反向剪接模型中，前體mRNA直接發生反向剪接形成circRNA。研究表明由外顯子形成的circRNA通常定位于細胞質[11]，少數外顯子circRNA定位于細胞核，且細胞核內circRNA的作用主要是為染色質招募蛋白質[12]。Li等[13]發現某些含有內含子的circRNA定位于細胞核內，主要調節其親本基因表達。細胞外間隙中的外泌體中也發現circRNA的存在[14]，外泌體中的circRNA異常表達在疾病的發生發展中起著重要作用，胃癌中的circRNA可以通過外泌體轉移到受體細胞中，表明外泌體circRNA在胃癌的侵襲和轉移中起重要作用[15]。circRNA的表達水平一般較低，且具有細胞特異性和組織特異性[16]。Rybak-Wolf等[17]觀察到circRNA在哺乳動物的大腦中顯著富集。Conn等[18]發現circRNA在人類上皮-間質轉化等某些生物過程中也顯著富集。

雖然circRNA的表達量普遍較低，但circRNA可在分子水平上通過不同的作用方式在生理和病理條件下發揮潛在的重要作用。circRNA的生物功能：①circRNA通過形成RNA-DNA雜交體與宿主基因的合成位點結合，導致轉錄暫?；蚪K止，從而上調外顯子跳躍或截短的轉錄本水平。②外顯子-內含子circRNA與U1小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein particles，snRNP）結合，然后與DNA聚合酶Ⅱ相互作用，增強親本基因的表達。③circRNA可作為競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）通過微小RNA（microRNA，miRNA）的反應元件與miRNA競爭性結合，間接調節miRNA靶向mRNA的表達。④circRNA可以與蛋白質相互作用。⑤含有內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）的circRNA可以直接招募核糖體并被翻譯。⑥YTH結構域家族蛋白3（YTH domain family protein 3，YTHDF3）可以識別含有N6-甲基腺嘌呤（N6-Methyladenosine，m6A）的circRNA，YTHDF3招募真核翻譯起始因子4G2（eukaryotic initiation factor 4G2，eIF4G2），從而觸發翻譯。這一過程可被甲基轉移 酶 樣3/14（methyltransferase like protein 3/14，Mettl3/14）增強，被脂肪量和肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated，FTO）抑制[8]。見圖1[8]。

圖1 circRNA生物學功能[8]

2 circRNA在PCOS患者中的差異表達

高通量測序和基因芯片的迅速發展推動了對circRNA在PCOS發病機制中的研究。為了研究circRNA的潛在作用，Wang等[19]對PCOS患者卵泡液外泌體中的RNA進行了circRNA測序，共鑒定出167個上調和245個下調的circRNA，進一步的功能分析表明，PCOS患者與細菌感染、慢性炎癥和氧化應激相關的通路可能受不同的circRNA調節。Huang等[20]也研究了PCOS患者卵泡液外泌體中差異表達的circRNA，發現16個circRNA的表達具有顯著差異，并證實了其中的hsa_circ_0006877（circLDLR）對顆粒細胞的增殖、凋亡以及激素分泌均有影響。

更多學者對顆粒細胞中circRNA的表達譜進行了研究。Che等[21]檢測了PCOS患者卵丘顆粒細胞中circRNA的表達譜，共鑒定出1 032個差異表達的circRNA，其中311個表達上調，721個表達下調。該研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）方法對測序結果中表達下調的4個circRNA（包括hsa_circ_0083952、hsa_cic_0082709、hsa_circ_0002425和hsa_circ_0015168）進行了驗證，結果顯示這4種circRNA在PCOS患者顆粒細胞中表達下調。Ma等[4]收集6例PCOS患者和6例因輸卵管因素等器質性病變行輔助生殖技術患者（對照組）的顆粒細胞進行circRNA基因芯片分析，結果鑒定出286個差異表達的circRNA（上調167個，下調119個），經qRT-PCR驗證，PCOS組hsa_circ_0043533和hsa_circ_0043532的 表 達 水平顯著升高，hsa_circ_0097636的表達水平顯著降低；而Zhang等[22]在15例PCOS患者顆粒細胞中發現4個circRNA上調，23個下調，后續qRT-PCR證實PCOS患者中hsa_circ_0001577基因表達上調，hsa_circ_0020093基因表達下調，提示這些circRNA參與了PCOS的發生發展，可能作為PCOS潛在生物標志物。

另有學者認為，PCOS孕婦的病理生理可能會導致胎兒表觀遺傳在子宮的重新編程，從而導致其后代生殖功能的異常[23]。Zhao等[5]發現，與正常產婦相比，PCOS患者的胎盤胎兒面組織中的circRNA有14個顯著上調，101個顯著下調。

3 circRNA異常表達在PCOS發病機制中的研究

3.1 circLDLR雄激素的產生受細胞色素P450家族19亞 家 族A成 員1（cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1，CYP19A1）基因表達的調節，CYP19A1編碼細胞色素P450芳香化酶。在卵巢中，芳香化酶負責將雄激素轉化為雌激素，其在PCOS卵母細胞發育障礙中發揮重要作用[24]。研究證明，在PCOS患者的卵巢組織中，CYP19A1的表達水平較低，卵巢芳香化酶活性和雌二醇產生減少[25]。

已有研究表明，circRNA通過與CYP19A1的相互作用在PCOS的發病機制中發揮重要作用。Huang等[20]比較了PCOS患者和因輸卵管因素等器質性病變行輔助生殖技術助孕患者（對照組）卵泡液外泌體中的circRNA表達譜，結果顯示16個circRNA表達差異顯著，其中下調的circLDLR是從其親本低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）基因加工而來，該基因參與了卵巢類固醇合成調節。該研究通過Cytoscape軟件預測了circLDLR-miR-1294-CYP19A1 ceRNA網絡，并通過熒光素酶實驗證實了circLDLR是miR-1294的分子海綿。人卵巢顆粒細胞瘤KGN細胞過表達circLDLR伴隨著miR-1294的下調、CYP19A1蛋白表達上調和雌二醇分泌增加；circLDLR水平下調導致miR-1294上調、CYP19A1蛋白表達下調以及雌二醇分泌減少。同時，轉染miR-1294類似物可以挽救KGN細胞外泌體中circLDLR的下調對CYP19A1表達和活性的影響?；诜枷慊冈谛奂に剞D化為雌二醇過程中發揮重要作用，circLDLR基因的異常表達可能是PCOS患者高雄激素血癥的重要發病機制之一。

可見，卵泡液中外泌體circRNA的變化可能是導致PCOS發生的重要原因，circLDLR通過海綿吸附miR-1294抑制CYP19A1而發揮調節雌二醇分泌的作用，參與了卵巢類固醇激素的合成，為進一步治療PCOS提供新的靶點和策略。

3.2 hsa_circ_0118530顆粒細胞的增殖分泌功能與卵母細胞的生長發育密不可分。顆粒細胞的異常增殖和凋亡影響卵泡成熟，PCOS患者卵泡發育不成熟則影響排卵，從而導致不孕[26]。Ma等[4]在PCOS患者卵丘顆粒細胞中發現并鑒定出了一種新的表達增加的circRNA，即hsa_circ_0118530。Jia等[6]進一步對hsa_circ_0118530在PCOS發病機制中的作用進行了分子研究，用hsa_circ_0118530小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染KGN細胞，結果顯示KGN細胞活力下調，細胞凋亡增加，細胞遷移顯著受到抑制；通過生物信息學分析和雙熒光素酶報告實驗驗證并確定了hsa_circ_0118530與miR-136之間的相關性，在KGN細胞中抑制miR-136可逆轉hsa_circ_0118530 siRNA對細胞生長的影響。但miR-136對PCOS發病機制的具體作用機制有待進一步研究?？梢?，hsa_circ_0118530通過調節miR-136促進PCOS的發生，為PCOS提供了一個新的治療靶點。然而，其是否可以直接或間接地影響卵巢功能，還需要進行深入的研究。

3.3 circASPHcircASPH起源于第4～14外顯子的天冬氨酸β-羥化酶（aspartate-β-hydroxylase，ASPH）基因的環化，在肺腺癌中最早被研究[27]，并且受到高遷移率族蛋白A2（high-mobility group A2，HMGA2）的調控；circASPH促進了肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Wu等[7]以KGN細胞為模型研究circASPH在PCOS中的潛在作用，發現過表達circASPH后KGN細胞的活力增加、凋亡降低，而敲低circASPH后KGN細胞的凋亡率明顯升高。同時，circASPH過表達顯著降低KGN細胞內活化的多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3）的蛋白水平，而敲低circASPH使活化的PARP和caspase 3蛋白的水平顯著增加。該研究證實miR-375是circASPH的靶點，補充miR-375類似物可以挽救KGN細胞中circASPH的下調引起的增殖抑制。該研究還發現，miR-375的下游靶基因是重組人絲裂原激活蛋白激酶激酶6（mitogen-activated protein kinase kinase 6，MAP2K6），在KGN細胞中與circASPH通過海綿吸附miR-375調節MAP2K6的表達。可見，circASPH在PCOS中起致病作 用，PCOS中 存 在circASPH/miR-375/MAP2K6的ceRNA網絡，這對PCOS的臨床診斷和治療具有重要意義。

3.4 circPUM1Deng等[28]推測miR-760可能參與了PCOS的進展，進一步研究表明miR-760在KGN細胞中表達降低；miR-760下調促進KGN細胞的增殖，抑制其凋亡。該研究應用生物信息學分析、RNA結合蛋白免疫沉淀法、雙熒光素酶報告實驗和RNA下拉實驗等證明，circPUM1對miR-760有海綿作用。該研究還發現circPUM1的過表達促進細胞的增殖，抑制細胞凋亡，而miR-760的過表達可以逆轉circPUM1下調對KGN細胞的生物學效應?？梢姡琧ircPUM1通過海綿吸附miR-760并負調控其表達，調節顆粒細胞的功能，揭示了特定的circRNA在PCOS進展中的作用，為PCOS分子機制研究提供了新的思路，并為PCOS的治療提供了潛在的治療靶點。

4 結語

PCOS的發病機制尚不明確，circRNA為探索PCOS的病因提供了一個很好的思路。circRNA可通過吸附miRNA在轉錄后水平調節相應靶基因的表達，參與PCOS類固醇的產生、顆粒細胞增殖與凋亡，繼而影響卵泡發育。目前對circRNA的生物發生和功能的理解已取得一定進展，但關于circRNA在PCOS中的研究仍處于初步階段，circRNA在PCOS發病中的具體作用機制仍需要更多的科學研究來驗證。目前研究表明circRNA的異常表達在PCOS的發生、發展中起著重要作用。深入詮釋circRNA的生物發生和調控會加深對RNA功能及其與PCOS關系的理解。深入對circRNA的研究有助于了解PCOS的發病機制，為PCOS未來研究方向提供新思路，更為PCOS患者個體化治療及長期管理提供更好的理論基礎。