miR-144 在宮頸癌中的研究進展

王君，俞彩仙，王俠，李政

宮頸癌居于全球女性最常見惡性腫瘤的第4位，也是導致我國女性惡性腫瘤相關死亡的最主要原因之一[1]。目前在高收入國家宮頸癌的發病率和死亡率下降明顯，但對于低收入國家的宮頸癌患者總體預后仍然很差[2]，并且一旦發生復發轉移，患者的預后會進一步降低，因此在未來很長一段時間內宮頸癌仍將造成沉重的疾病負擔。因此，進一步探索宮頸癌發生發展的分子機制至關重要，爭取做到早期診斷、早期治療，對于提高宮頸癌患者的生存率至關重要。微小RNA（microRNA，miRNA）在轉錄后調控基因的表達，其主要通過靶向mRNA 的3′-UTR 和種子區來介導靶基因的轉錄后基因沉默[3]，參與細胞發育、增殖、分化、侵襲和凋亡等重要生物學過程[4]。目前已有多項研究證實miR-144 參與了多種腫瘤的發生和發展。Yin 等[5]發現miR-144 通過靶向調控CEP55 基因抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移；高通量芯片研究顯示，miR-144 在胃癌[6]、結腸癌[7]、肺鱗狀細胞癌[8]中的表達均顯著下調。目前有大量相關研究表明miR-144 通過多種信號通路影響宮頸癌的發生發展，并參與宮頸癌對化療敏感性的調控，有望作為宮頸癌早期診斷的潛在生物學標志物和治療靶點。

1 miR-144 的生物學功能

MiR-144 作為一種高度保守的非編碼的RNA，其發夾能夠產生“導向鏈”miR-144-5p 和“姊妹鏈”miR-144-3p[9]。MiR-144 最初被認為是一種類紅細胞特性的miRNA，大量存在于血清中，對后續類紅細胞譜系的存活和成熟是必不可少的。在胃癌中，miR-144 通過調控靶基因ZFX 抑制胃癌細胞的增殖，同時提高了胃癌細胞對5-氟尿嘧啶的化療敏感性[10]。在胰腺癌中，miR-144 可以通過調控靶基因PRR11 誘導胰腺癌細胞的細胞周期停滯和凋亡，因此靶向miR-144-3p 可以作為治療胰腺癌的潛在治療策略[11]。

2 miR-144 抑制宮頸癌細胞的增殖及轉移侵襲

血管生成在腫瘤細胞的增殖過程中起著至關重要的作用[12]。目前已知的幾種關鍵信號分子，包括血管內皮生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、轉化生長因子β（TGF-β）以及血管生成素1和2[13]。其中，對VEGF-A 及其受體在新生血管形成中的作用機制最為明確。VEGF-A 能與Flk1 和Flt1相互作用，調節大部分的內皮反應，包括內皮細胞的增殖和遷移、血管通透性以及尖端細胞絲狀足的誘導[14]，進而參與新生血管的形成。腫瘤細胞增殖依賴新生血管生成，因此在幾乎所有的惡性腫瘤中都發現VEGF-A、VEGF-C 的廣泛表達[13]。研究表明，下調miR-144 能通過解除對靶基因VEGF-A 和VEGF-C的抑制作用，促進宮頸癌細胞的增殖和侵襲[15-16]。Tao 等[16]進一步通過生物信息學分析的方法預測miR-144 可能的靶基因，發現在VEGF-A mRNA 和VEGF-C mRNA 的3′-UTR 中存在miR-144 結合位點，將攜帶miR-144 模擬物以及模擬物對照組的載體轉染HeLa 細胞進一步驗證兩者之間的關系，通過VEGF-A 和VEGF-C 的熒光素酶報告實驗發現經miR-144 模擬物轉染的HeLa 細胞的相對熒光素酶活性明顯低于對照組，而當VEGF-A 和VEGF-C 的3′-UTR 結合位點的寡核苷酸發生突變時，模擬物組與其對照組的熒光素酶活性基本一致，該研究同時補充了逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）和蛋白質印跡（Western blotting）實驗，在HeLa 細胞中過表達miR-144 后，VEGF-A 和VEGF-C 的mRNA 和蛋白表達水平顯著下降，這些實驗結果都證實了miR-144 靶向調控VEGF-A 和VEGF-C 基因的表達抑制宮頸癌細胞增殖。Wu 等[17]通過對1 組正常宮頸上皮細胞株（HcerEpic）、6 組宮頸癌細胞株（HeLa、C33A、HT-3、ME-180、HCC94 和MS751）和23 例宮頸癌患者的新鮮組織樣本（癌及癌旁組織）進行了RT-qPCR，發現miR-144-3p 在宮頸癌細胞株和新鮮癌組織樣本中低表達，為進一步驗證其對腫瘤增殖的影響，選擇了2 株miR-144-3p 表達水平最低的細胞株（Hela和HCC94），通過轉染miR-144-3p 模擬物來恢復其表達，檢測了細胞72 h 的增殖情況，發現miR-144-3p 的表達恢復明顯降低了HeLa 細胞和HCC94 細胞的增殖率。

宮頸癌腹膜后淋巴結轉移是宮頸癌預后最為重要的因素，同時也是宮頸癌細胞轉移侵襲能力的體現[18]。Ding 等[19]通過比較盆腔淋巴結轉移陽性、陰性的宮頸鱗癌患者的癌組織miRNA 表達譜發現，miR-144 在盆腔淋巴結轉移陽性癌組織中的表達顯著低于盆腔淋巴結轉移陰性的癌組織，運用生物信息學預測miR-144 可能的靶基因發現，這些靶基因編碼的蛋白通過參與細胞黏附、細胞骨架重塑、細胞遷移和凋亡等過程，進而調控細胞的轉移和侵襲。多項研究已證實miR-144 對宮頸癌細胞轉移和侵襲能力的影響是多途徑的。Wu 等[17]發現下調miR-144-3p 可能通過靶向調控絲裂原活化蛋白激酶6（mitogen-activated protein kinase 6，MAPK6）促進EMT 促進宮頸癌細胞的轉移和侵襲，該研究將攜帶miR-144-3p 模擬物以及模擬物對照組的載體轉染Hela 細胞株后，通過熒光素酶報告實驗以及RT-qPCR檢測MAPK6 的表達，證實MAPK6 是miR-144-3p內源性靶點。而MAPK6 作為MAPK 家族中的一員，可以通過ras-MAPK 途徑激活Snail 和Slug[20-21]，Snail 又與E-鈣黏蛋白啟動子結合并抑制其轉錄，同時Slug 的激活可以觸發細胞-細胞邊界的橋粒破壞、細胞擴散和部分分離等過程，這些過程都是EMT的必要階段[22]。競爭性內源性RNA（ceRNA）分子網絡在促進宮頸癌的發生過程中發揮著重要的調控作用[23]。Zhu 等[24]研究發現miR-144 也參與ceRNA 分子網絡的調控，lncRNA ATB 是miR-144 的ceRNA，并且通過抑制miR-144/ITGA5 軸促進宮頸癌細胞增殖和轉移侵襲。多項研究已證實脂肪酸代謝在腫瘤細胞增殖、轉移和侵襲中起著重要作用，Zhang等[25]發現，miR-144 能顯著抑制宮頸癌細胞中脂肪酸結合蛋白5（fatty acid-binding protein 5，FABP5）的表達，而FABP5 能夠重編程宮頸癌細胞的脂肪酸代謝，促進細胞內EMT 的發生和淋巴管的生成，進而促進宮頸癌細胞的轉移和侵襲。同時，該研究發現宮頸癌細胞中miR-144 的低表達可能是由缺氧環境誘導的，這也為miR-144 在宮頸癌中的上游調控機制提供了研究思路。上述研究中miR-144 主要通過調控VEGFs 和EMT 過程抑制宮頸癌細胞的增殖和轉移侵襲，而在2019 年Sheng 等[7]關于結腸癌的研究發現，miR-144 通過調控靶基因SMAD4 抑制結腸癌細胞的增殖、侵襲和轉移，這也為miR-144 在宮頸癌細胞增殖和轉移侵襲的研究提供了新的研究思路。

3 miR-144 作為宮頸癌早期診斷和臨床分期的潛在生物學標志物

人乳頭瘤病毒（HPV）感染作為宮頸癌最明確的病因之一，已被廣泛使用在宮頸癌早期病變的篩查過程中[2]，但目前宮頸癌暫無作為早期診斷的生物學標志物。隨著對miR-144 在宮頸癌中作用的研究不斷深入，越來越多的證據表明miR-144 的失調與宮頸癌的發生發展密切相關。Shi 等[26]通過從惡性腫瘤基因組圖譜（TCGA）數據庫獲取的宮頸癌表達數據，利用隨機森林算法來描述用于病理分期預測的最優miRNA 子集，共鑒定了44 個差異表達的miRNA，確定了7 個miRNA 的最佳子集，其中包括has-miR-144，該研究認為獲得的標志性miRNA 的子集可能成為宮頸癌早期診斷和病理分期的生物學標志物。Yang 等[27]通過對TCGA 數據庫中248 例不同組織學分級的宮頸癌患者的miRNA 表達譜分析，獲得5 個差異表達的miRNA，其中包括has-miR-144，同時該研究將這248 例患者按照組織學分級劃分為4 組（分別為高分化組、中分化組、低分化組和未分化組），發現miR-144 的表達不斷遞增，miR-144 與宮頸癌分化程度呈負相關。同時在不同宮頸癌患者的新鮮癌組織樣本的miRNA 表達譜研究中發現，淋巴結轉移陽性宮頸癌標本中miR-144 的表達量顯著低于淋巴結轉移陰性宮頸癌標本，進一步說明了在宮頸癌不同分化類型和疾病進展過程中存在差異表達。臨床上宮頸癌病理分期多采用國際婦產科聯盟（FIGO）分期，不同FIGO 分期的宮頸癌臨床標本中，miR-144 是否存在差異表達？差異表達趨勢和宮頸癌FIGO 分期存在怎樣的關系？另外，有研究發現，miR-144 在HPV16 陽性的患者和HPV16 陰性的患者血清標本中存在表達差異，在HPV16 陽性患者的血清樣本中表達顯著上調，這與miR-5701 相似[28]，miR-5701 已成為宮頸癌早期診斷的生物學標志物，那么miR-144 同樣能夠抑制宮頸癌細胞的增殖轉移且穩定在血清中循環，推測其也可能作為HPV16 陽性患者早期診斷宮頸癌的生物學標志物，但還需要進一步驗證。

4 miR-144 作為改善宮頸癌化療耐藥的治療靶點

化療耐藥已成為宮頸癌患者治療過程的重大阻礙。隨著對miRNA 研究的深入，越來越多的證據表明miRNA 在腫瘤化療耐藥中發揮著重要的作用，能夠作為腫瘤治療的新型靶標[29]。Shi 等[30]發現miR-144 通過靶向LHX2 促進宮頸癌細胞凋亡，從而克服了對順鉑的耐藥性，該研究發現在對順鉑耐藥的宮頸癌細胞株中過表達miR-144 能夠抑制LHX2 的表達進而誘導細胞凋亡，推測miR-144 通過調控下游靶基因抑制宮頸癌化療順鉑耐藥，可能成為宮頸癌的治療靶點。近期對腫瘤化療耐藥的機制研究發現腫瘤細胞在產生獲得性耐藥的過程中有間質化的趨勢，同時本身具有間質分化狀態的腫瘤細胞也常表現為原發性耐藥，因此EMT 過程已逐漸被認為是腫瘤耐藥的一個新的重要機制[31]。EMT 相關轉錄因子（Zeb1、Slug）在腫瘤化療耐藥中起關鍵調控作用，抑制EMT 相關轉錄因子活性，可以逆轉耐藥細胞間質化狀態，實現對腫瘤化療的敏感，宮頸癌中下調miR-144 通過靶向調控MAPK6 促進EMT相關轉錄因子的表達，進而誘導宮頸癌細胞發生EMT[17]，可能導致宮頸癌細胞化療耐藥的發生。

5 miR-144 對宮頸癌預后的影響

下調miR-144 通過調控靶基因參與宮頸癌的發生發展，促進宮頸癌細胞的增殖、轉移、侵襲、化療耐藥等過程，這些都預示著低表達miR-144 導致宮頸癌的預后差。但在一項將OTUD5 作為宮頸癌潛在生物標志物和治療靶標的研究中，miR-144 高表達的宮頸癌患者的總生存率顯著低于低表達者[32]，這與之前的研究結論相悖。由于目前關于miR-144 對宮頸癌患者預后影響的研究較少且存在差異，其能否預測宮頸癌的預后還需進一步研究探討。

6 結語和展望

在宮頸癌中，miR-144 通過調控功能明確的下游靶基因（如VEGF、MAPK6）以及參與ceRNA 分子網絡、EMT 途徑等抑制宮頸癌細胞的增殖和轉移侵襲，并且通過誘導宮頸癌細胞的凋亡參與到宮頸癌化療耐藥的過程中，有望成為潛在的治療靶點。miR-144 在宮頸癌患者的新鮮癌組織以及血清中均穩定表達且顯著下調，同時其在HPV16 陽性和HPV16 陰性患者的血清中存在顯著的表達差異，這都為miR-144 作為宮頸癌早期診斷的生物學標志物提供了堅實的基礎，而宮頸癌中下調的miR-144能否作為其病理分期和預后標志仍需更進一步地研究。相信隨著實驗研究地深入，miR-144 在宮頸癌中的作用和機制也將進一步明確。