p16/Ki67和E6/E7 mRNA在宮頸癌篩查中的研究進展（綜述）

王 俠

宮頸癌目前已成為僅次于乳腺癌的女性常見惡性腫瘤之一。宮頸癌通常由低級別或高級別的鱗狀上皮內病變演變而來，因此早期對女性宮頸癌篩查顯得十分重要。既往的研究是基于巴氏（Pap）涂片的宮頸癌篩查，被廣泛認為是最重要的策略，并在過去幾十年中降低了宮頸癌的發病率和病死率[1]。隨著對分子生物學和人乳頭瘤病毒（HPV）研究的迅速發展，出現了一系列簡便的宮頸癌篩查方法。多數篩查方法依賴于HPV-DNA的檢測，其中包括第二代雜交捕獲法（HC-2）、Cervista HPV HR和Cobas-HPV。這些方法具有高重復性和可接受性等優點。然而，這些基于DNA的檢測方法往往因其不理想的性能而受到限制。近年來據報道，免疫組織化學或原位雜交結合細胞形態學評價可預測低級別病變，因此，適當地結合使用生物標記物可以顯著地提高檢測效率以促進早期宮頸惡性腫瘤的治療效果。本綜述主要總結了近五年來國內外宮頸癌篩查指標p16蛋白、Ki67蛋白、E6/E7 mRNA以及聯合檢測的相關研究進展，以期在病理方面探尋更佳的宮頸癌篩查方法，為了在浸潤性癌發生之前發現并治療宮頸上皮內瘤變（CIN），降低宮頸癌轉診率，提高臨床診療效率。

1 p16/Ki67在宮頸上皮內瘤變中的診斷價值

p16INK4a（p16）是一種在細胞周期調控中起關鍵作用的抑癌蛋白，是繼p53之后第二常見的腫瘤抑制基因。p16的過度表達被認為是E7表達不受調控的替代標志物，也作為人類乳頭狀瘤病毒（HPV）感染的指標，在HPV相關腫瘤中高表達[2]。Ki67是一種細胞增殖標志物，近年來被發現其作為分子標志物用于不同腫瘤細胞診斷治療與預后[3]。生理條件下p16和Ki67蛋白的表達不會共同發生，因為它們通常具有相互排斥的表達效應。當宮頸上皮內共同表達p16與Ki67時，可能出現細胞周期調控失常。因此，在傳統診斷方法的基礎上，可以通過生物標記物來提高宮頸癌篩查的準確性，特別是轉化型HPV感染。Ruiyi Zhang等[4]研究表明在CIN2檢測中p16/Ki67雙重染色的特異性為68.33%，顯著高于細胞學（38.33%）和HRHPV檢測（21.67%）。在不典型鱗狀細胞病變中，p16/Ki67雙染的特異性顯著高于HPV檢測，敏感性卻與HPV檢測相似。對于HR-HPV陽性CIN2的敏感性和特異性均高于細胞學和 HPV16/18檢測。因此，p16/Ki67雙染實驗提高了CIN2檢測的特異性，相應地減少了陰道鏡轉診。Qiu-Ping Qian等[5]發現雙染具有很高的重復性，且聯合檢測液基細胞學和p16/Ki67雙染色顯示出最高的特異性，這種方法可用于那些潛在受宮頸癌影響的患者的分類診斷中。此外學者們提出不同陽性率的p16/ Ki67的表達對CIN分級具有較高的診斷價值，隨著CIN分級的提高，陽性表達率呈現出逐漸上升的發展趨勢，且聯合診斷的敏感性、特異性以及準確率均高于單獨使用p16診斷宮頸鱗狀上皮內病變[6]。此外，研究發現液基細胞學聯合p16/Ki67用于診斷宮頸上皮內瘤變的準確率和敏感性顯著高于單獨檢測組[7]。由此可說明p16/Ki67分子標志物可以反映宮頸上皮內瘤變的分級，且不同級別表現出不同的特異度。

2 E6/E7 mRNA在宮頸上皮內瘤變中的診斷價值

E6/E7基因的表達是HPV持續感染和宮頸惡性轉化的必要條件。在宮頸上皮細胞癌變過程中，HPV將其E6/E7 DNA整合到宮頸上皮細胞基因組中，使上皮細胞獲得癌基因，在致癌因子的作用下被激活，轉錄成E6/E7 mRNA，并且進一步翻譯成癌蛋白E6/E7，它們分別與抑癌蛋白P53和PRB結合，導致P53和PRB失活，最終導致宮頸癌的發生。因此，HPV E6/E7 mRNA檢測不僅可以提示HPV感染，而且可以在一定程度上反映E6/E7基因的表達和病變程度。Ren C等[8]發現HPV E6/E7 mRNA的表達水平是高級別CIN和宮頸癌的危險因素。HPV E6/E7 mRNA定量分析對ASCUS巴氏涂片的診斷具有較高的敏感性和特異性。E6/E7mRNA定量檢測作為ASCUS患者的分型試驗具有較高特異性，可降低為陰道鏡檢查的低轉診。Yang L等[9]通過meta分析指出HPV E6/E7 mRNA陽性作為一種不良的預后因素提示意義不明確的非鱗狀上皮細胞（ASCUS）的女性處于危險狀態，應及時做陰道鏡轉診并加強隨訪。而HPV E6/E7 mRNA陰性的女性可綜合考慮個體差異，減少不必要的陰道鏡檢查，減輕患者的心理負擔。此外，采用HPV RNA熒光原位雜交技術也可以提高CIN診斷形態學不明確病例的準確性[10]。如前所述，p16/Ki67的存在是HPV相關宮頸癌中HRHPV感染的替代標記物。然而，p16INK4a往往導致對染色結果評判的偏倚，而Ki67在宮頸癌中的診斷價值尚不明確。因此Chen T等[11]研究表明與p16和Ki67免疫雙染相比，HR-HPV E6/E7mRNA原位雜交技術宮頸癌具有高度的敏感性和特異性。然而最新的研究發現，薄層液基細胞學檢查（TCT）聯合人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA檢測的靈敏度和特異度高于單獨檢測組，具有較高的臨床篩查價值[12]。總之，HPV E6/E7mRNA定量檢測有望解決HR-HPV DNA檢測特異性低的ASCUS巴氏涂片分流問題，避免不必要的陰道鏡檢查和活檢，降低患者的醫療費用，減少醫療資源的浪費。

3 聯合檢測p16/Ki67與E6/E7 mRNA在宮頸上皮內瘤變中的診斷價值

近年來國內學者發現HPV E6/E7 mRNA和p16/ki67免疫細胞化學雙染檢測有一定的臨床意義，兩者進行聯合檢測明顯提高了分流診斷的靈敏度和特異度。此外，相比于單獨檢測，聯合應用明顯提高了CINⅡ(+)病變的靈敏度，提高了篩查效率，具有一定的臨床應用價值[13]。然而Zhu Y等[14]發現p16/Ki67免疫細胞化學和HPV E6/E7 mRNA檢測都比HPV DNA檢測有更高的特異性，而p16/Ki67免疫細胞化學比HPV E6/E7 mRNA檢測具有更高的敏感性。針對兩者聯合檢測對宮頸癌篩查及分型仍需進一步探索。

p16基因是一種腫瘤抑制基因，位于人類第9號染色體上，其產物p16蛋白在細胞增殖與分裂過程中發揮負調控作用。許多文獻指出，p16蛋白在不同宮頸上皮內瘤變中存在差異，且與CIN病變程度呈正相關。此外，p16表達水平與HPV感染密切相關。Ki67是一種與細胞周期密切相關的細胞核增殖性抗原，被發現可能與腫瘤發生密切相關，并反映腫瘤細胞增殖活性[15]。臨床上人們通過實驗證明p16/Ki67雙染對宮頸上皮內瘤變的診斷意義較大，具有較高的敏感性與特異性，可推薦在臨床上用于CIN分級診斷。

高危型HPV持續感染狀態被認為是宮頸癌的最主要病因。HR-HPV的基因組參與病毒自身的復制、轉錄、翻譯等過程，其晚期區負責編碼HPV衣殼蛋白，在上皮細胞的內吞過程中發揮重要作用。E6蛋白作用于p53基因，控制基因表達過程中的各個環節。E7基因編碼的蛋白主要是結合到腫瘤抑制蛋白Rb上而引起了Rb降解，導致E2F轉錄因子以游離形式存在，激活參與細胞周期的相關基因，最終導致細胞呈增殖狀態。宮頸HPVDNA檢測陽性只能表明病毒存在，而HPV E6/E7 mRNA檢測陽性可說明病毒已整合入宮頸上皮細胞基因組內并發生了基因表達，處于持續性感染的狀態。宮頸上皮內病變患者存在HPV E6/E7 mRNA異常高表達，且宮頸上皮內病變分級是宮頸錐切術后疾病持續復發的高危影響因素，可隨病變程度的增加而上升，因此，高級別宮頸上皮內病變發生宮頸癌的危險性較大。Pruski D等[16]研究發現高級別鱗狀上皮內病變與HPV E6/E7 mRNA陽性密切相關，故HPV E6/E7 mRNA是鑒別腫瘤病變和宮頸癌相關性的重要依據且檢測靈敏度和特異性隨著年齡的增長而增加。

4 小結與展望

診斷早期宮頸癌的不可或缺的環節是宮頸上皮內瘤變。因此，早期發現宮頸上皮內瘤變對預防宮頸癌極其重要。目前國際公認準則采用三階梯宮頸癌篩查程序，即宮頸涂片細胞學檢查、陰道鏡檢查、宮頸組織病理學檢查，使得宮頸癌的檢出率顯著提高。然而宮頸脫落細胞學檢查往往根據病理科醫師自身經驗進行診斷，具有主觀性，易造成假陽性或假陰性。組織活檢雖作為診斷宮頸病變的“金標準”，但屬于有創檢查，不利于大面積篩查。本綜述旨在總結近年來臨床上宮頸癌篩查中常用的簡便可靠的分子標志物的特點及臨床應用價值，目的是為臨床宮頸癌篩查提供重要的分子診斷依據。檢測HPV E6/E7 mRNA對早期診斷宮頸癌具有重要意義。然而，學者們并不僅僅局限于這幾類標志物的檢測[17]，越來越多用于宮頸癌篩查的生物標志物將被逐步發現并應用。通過檢測p16/Ki67、HPV E6/E7 mRNA，探討其在宮頸癌篩查中的作用，從而了解分子生物學技術用于宮頸癌篩查與早期診斷，為臨床應用提供了堅實的理論依據。