基于網絡藥理學和分子對接探討黃芪治療糖尿病周圍血管疾病的分子機制*

嚴仕夢，閆少慶，楊曉，王麗翔，柳國斌

上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200021

糖尿病周圍血管疾病(diabetic peripheral vascular disease，DPVD)是糖尿病患者在長期病程中發生的以下肢為主的外周大、中、小動脈血管粥樣病變為主的慢性并發癥，臨床表現為下肢皮膚干燥，肢體感覺發涼麻木、酸脹感、出現靜息痛、間歇性跛行等臨床癥狀，病程后期可出現干性壞疽[1]。糖尿病患者受高血糖影響，出現一系列血管硬化、增厚、彈性下降等周圍血管病變，是患者非外傷致殘的主要原因之一[2]。目前治療糖尿病周圍神經血管病變主要從控制血糖、改善微循環等方面入手，但總體療效欠佳。在治療DPVD方面，中西醫結合治療效果更佳，且不良反應少[3]。中醫學認為本病以虛為本，瘀為標，通過對DPVD中醫用藥規律進行聚類分析，發現其中黃芪在補氣治療應用中占據首位，黃芪是中醫學治療DPVD的關鍵組分[4]。

黃芪，多年生草本植物，為豆科植物蒙古黃芪的干燥根，藥用歷史悠久，最早記載于《神農本草經》，具有固表止汗、生津養血等功效[5]。古代常稱黃芪為“黃耆”，指的就是黃芪為補氣之長，補氣之要藥。現代研究表明，黃芪能夠增強免疫功能，增強機體耐缺氧能力和應急能力，促進機體代謝等功能[6]。網絡藥理學是近年來新興的一種強大藥物作用分析工具，將藥物網絡與生物結合，為藥物療效的深入機制分析提供證據，在研究中醫藥療效方面發揮著重要作用，為傳統中藥在分子微觀水平探討多重藥理機制提供了諸多可能[7]。分子對接Autodock Vina 采用的是半柔性對接的方式，受體為剛性，只改變小分子配體，根據拉馬克遺傳算法在格點盒子中依次計算格點能，尋找結合能最低的結構象，具有花費時間少、效率高、精度佳的特點。目前黃芪治療DPVD的研究仍較少，機制研究匱乏。本研究基于網絡藥理學和分子對接探索黃芪治療DPVD的有效成分和作用靶點，篩選關鍵組分，為研究黃芪治療DPVD進一步研究和應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 篩選黃芪的有效化學成分和治療疾病靶點通過TCMSP數據庫檢索藥物黃芪，得到成分87個。通過口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18對有效成分進行篩選[8]，得到黃芪有效成分20個。利用TCMSP數據庫搜尋黃芪有效化學成分中的每個靶點的信息，通過Perl數據包結合Uniprot數據庫(https：//www.uniprot.org/)對得到的藥物靶點進行規范。以關鍵詞 “Diabetic Peripheral Vascular Disease”在GeneCards、OMIM數據庫篩選疾病靶點基因并進行合并去除重復值，然后對規范化后的藥物靶點基因和GeneCards、OMIM中篩選得到的疾病靶點基因取交集，得到藥物-靶點基因韋恩圖。

1.2 疾病-藥物-主要成分-靶點網絡可視化將黃芪-DPVD的共同靶點基因和黃芪治療疾病主要成分相關靶點信息導入Cytoscape (3.7.2)進行處理，順序導入疾病、藥物分子網絡信息和節點類型，呈現疾病-藥物-關鍵化學分子-疾病靶點可視化網絡。

1.3 蛋白質互作網絡構建和核心作用靶點篩選進入String數據庫構建蛋白質互作網絡(protein protein interaction network，PPI)，選擇人源物種，導入黃芪-DPVD的交集基因，得到蛋白互作網絡，將蛋白關系評分設為高級別0.7，隱藏游離蛋白，黃色連線表示文本挖掘證據，藍色連線表示基因共進化證據，紅色連線表示基因融合證據等，下載PNG格式PPI蛋白互作圖，保存PPI互作TSV文件，導入Cytoscape，運用MCODE插件分析核心作用靶點。

1.4 GO和KEGG富集分析通過Perl語言數據包轉換交集基因名稱為基因ID。安裝R語言數據包，設置pvalue<0.05，qvalue<0.05對基因ID進行GO和KEGG富集分析，輸出結果繪制barplot柱狀圖[9]。

1.5 分子對接驗證在TCMSP網站下載黃芪治療DPVD主要藥物成分的mol2結構式，運用AutoDock tools(1.5.6)進行處理，通過加氫，計算電荷數目，合并非極性氫后保存為pdbqt格式。從RCSB PDB數據庫(https：//www.rcsb.org/)下載PDB格式的核心靶點蛋白結構，運用AutoDock tools(1.5.6)進行同樣的處理，根據每個受體蛋白結構的不同，定義不同的Grid Box盒子。運用Autodock Vina(1.1.2)進行藥物配體和靶點蛋白的對接，選取每個藥物配體結合能最低的結合能。計算黃芪主要成分中每個成分與10個核心靶點的平均結合能，取絕對值，繪制平均結合能絕對值條形圖，將得到的受體配體復合體導入Discovery Studio (3.5)客戶端轉換pdb格式，然后導入Pymol 軟件(1.7)，導出圖片格式。

2 結果

2.1 黃芪有效成分篩選通過查詢TCMSP平臺獲得黃芪成分列表，經過生物利用度OB，藥物相似性DL篩選出20種有效成分。

2.2 預測藥物-疾病靶點通過TCMSP數據庫逐個查詢黃芪有效成分，匯總所有靶點，運用Perl語言包進行基因名稱注釋標準化。在GeneCards和OMIM數據庫中搜索DPVD的靶基因，共獲得靶點 7 469 個。通過R包對黃芪靶點和DPVD的靶點繪制韋恩圖(見圖1)，篩選出98個交集靶點，可能是黃芪治療DPVD的潛在作用靶點。

圖1 黃芪與DPVD靶點交集韋恩圖

2.3 疾病-藥物-關鍵藥物分子-靶點網絡構建通過Cytoscape 軟件對疾病-藥物-關鍵藥物分子-靶點可視化處理，記錄疾病藥物共同靶點所對應的化合物，最終得到黃芪-DPVD的關鍵化學成分16個，見表1。根據節點屬性及網絡關系，構建網絡可視化圖，見圖2。

表1 黃芪作用DPVD主要成分

圖2 黃芪與DPVD網絡可視化圖

2.4 蛋白質互作核心網絡構建將98個共同靶點基因導入String數據庫，繪制蛋白互作網絡分析圖，見圖3。其中評分≥0.997的互作蛋白為VEGFA-KDR、NOCOA2-AR、MAPK8-JUN、KDR-VEGFA、F7-F3、EGRF-EGF、PPARG-NCOA2、PPARG NCOA1、RXRA-PPARG、NCOA2-RXRA、NCOA1-ESR1、NCOA1-RXRA。這些蛋白在PPI網絡中起著重要作用，可信度高。將TSV文件導入Cytoscape，運用MCODE插件分析核心基因，分別為EGF、CCL2、VEGFA、MAPK8、IL-6、PPARG、JUN、MMP2、MMP1、IL-1B，見圖4。

圖3 黃芪靶標蛋白質互作網絡圖

圖4 核心基因網絡圖

2.5 GO和KEGG富集分析結果通過富集分析，篩選出前20條GO生物學過程，排名靠前的生物學過程包括肽結合活性，酰胺結合活性，絲氨酸水解酶活性，內肽酶活性，G蛋白偶聯胺受體活性，神經遞質受體活性，絲氨酸型內肽酶活性，絲氨酸型肽酶活性，核受體活性轉錄因子活性，直接配體調節的序列特異性DNA結合氧化還原酶活性等，見圖5。通過富集分析，篩選前20條KEGG相關信號通路，包括流體剪切力與動脈粥樣硬化通路，糖尿病并發癥糖基化及糖基化受體信號通路，IL-17信號通路，TH17細胞分化通路，雌激素信號通路，TNF信號通路，內分泌抵抗通路，表皮生長因子酪氨酸激酶抑制抵抗信號通路等，見圖6。黃芪可以通過眾多生物學調控發揮治療DPVD的作用。

圖5 黃芪靶標GO富集分析

圖6 黃芪靶標KEGG富集分析

2.6 分子對接驗證通過運用AutoDock Vina對核心靶點基因和黃芪主要成分依次對接，計算每個基因和黃芪每個成分的最低結合能，運用R包繪制黃芪成分與核心靶點的熱圖，見圖7。分子對接中，結合能的絕對值越大，則化合物越能與靶點更好地結合，產生穩定的構象。當結合能>5.0時，提示化合物與靶點有較好的結合活性，結合能>7.0時，具有強烈的結合活性[10]。黃芪主要成分與核心靶點大部分能產生較好的結合能，部分結合能達到了-10 kJ·mol-1，其中黃芪異黃烷苷(MOL000379)、白樺脂酸(MOL000211)、葉酸(MOL000433)平均結合能均>7，提示與核心靶點有較好的結合能，見圖8。選取3種成分與靶點最高結合能進行卡通結構呈現，黃芪異黃烷苷與JUN和VEGFA(結合能-8.8 kJ·mol-1)，白樺脂酸與VEGFA(結合能-9.1 kJ·mol-1)，葉酸與JUN(結合能-9.1 kJ·mol-1)，呈現二維結構圖，見圖9。

圖7 黃芪主要成分與靶標的分子對接熱圖

圖8 黃芪主要成分平均結合能絕對值圖

注：A：黃芪異黃烷苷與VEGFA蛋白結合；B：黃芪異黃烷苷與JUN蛋白結合；C：白樺脂酸與VEGFA蛋白結合；D：葉酸與JUN蛋白結合圖9 黃芪核心成分靶點結合卡通模式圖

3 討論

DPVD歸屬中醫“血痹”“脫疽”范疇，屬消渴并發癥類，病機屬氣陰兩虛，可兼夾濕痰等，中醫藥治療DPVD具有較好的療效[11]?！盃I氣虛則不仁”(麻木不仁、不會感知)，“衛氣虛則不用”(不能視聽言動)。黃芪為補氣之要藥，尤擅長補營衛之氣，能夠補充DPVD患者中氣虛之象，氣旺則血行，氣血充盈，周身濡養。本研究通過網絡藥理學方法，利用TCMSP數據庫平臺發現黃芪有87種成分，運用DL值和OB值篩選出20種有效成分，對應成分靶點104個，通過繪制交集韋恩圖，篩選出主要成分16種，核心靶點98個，占黃芪成分靶點的94%，富集主要GO和KEGG通路20條，提示黃芪能夠調控動脈硬化和血管壓力、糖尿病并發癥糖基化代謝、TNF、IL-17炎癥調節、EGFR血管內皮生長因子通路調控等通路，介導核受體活性、G蛋白耦聯受體、膽固醇激素等受體活性，在治療DPVD中能夠發揮多靶點調控效應。黃芪治療DVPD與IL-6、JUN、MAPK1、MAPK8、VEGFA、EGF、IL-1B等基因調控密切相關，下游蛋白存在較強的相互作用，而這些蛋白多與DPVD中炎癥因子、血管再生、信號凋亡通路等密切相關。研究表明，異鼠李素(MOL000354)能夠改善 α-葡萄糖苷酶活性調節血糖[12]；刺芒柄花素(MOL000392)通過調節大鼠子宮、胸主動脈和乳腺組織血管內皮細胞中IGF-1R和ICAM-1的表達，進而促進內皮細胞增殖和血管生成[13]；毛蕊異黃酮(MOL000417)能夠促進血管新生、抗氧化、保護內皮[14]。槲皮素(MOL000098)能夠調控PI3K/Akt促進內皮祖細胞促進損傷血管內皮修復[15]。黃芪主要成分中黃芪異黃烷苷、葉酸、白樺脂酸與DPVD平均結合能均較高，能夠與轉錄因子AP-1和血管內皮生長因子靶點在結構上發生較穩定結合，提示這3種成分可能在黃芪治療DPVD中發揮重要作用。林輝等[16]通過采用不同劑量葉酸(MOL000433)干預冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者，臨床研究發現，葉酸具有改善血管內皮功能。白樺脂酸(MOL000211)具有穩定的抗炎作用，可以影響多重炎癥信號通路[17]。而目前黃芪異黃烷苷的研究較少，但通過網絡藥理學推測其可能為黃芪治療DPVD的核心成分之一，在今后研究中可以進一步對其進行挖掘研究。

本文從網絡藥理學角度出發，探討了黃芪治療DPVD中可能存在的內在機制，發現黃芪主要成分可能對DPVD發揮多靶點調控作用，并通過分子對接發現黃芪主要成分均能與DPVD核心靶點有較好的穩定結合，提示黃芪可能在治療DPVD中發揮重要作用，為臨床診療及DPVD分子機制研究提供一定的參考。