參附注射液對膿毒癥模型小鼠脾臟淋巴細胞Treg/Th17免疫平衡的影響*

吳崢嶸，李淵，郝素英

北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078

膿毒癥是指機體對感染導致的宿主免疫功能失調而引起的危及生命的器官功能障礙[1-2]，對人類健康造成了巨大威脅，已成為全球范圍內危重患者死亡的主要病因[3]。研究表明，免疫抑制是膿毒癥晚期最重要的變化，膿毒癥患者因免疫功能低下導致反復出現全身性嚴重感染[4]。中醫學認為，膿毒癥的病機為邪毒內陷、正氣無力、抗邪之氣微陽脫、臟腑衰弱所致的氣機逆亂。參附注射液由人參、附子組成，具有益氣扶正、補氣通陽的功效[5]。研究表明，參附注射液可以通過調節膿毒癥患者的免疫功能，維持免疫和炎癥之間的平衡，從而改善臨床癥狀[6-7]。研究顯示，T淋巴細胞凋亡與膿毒癥后期的免疫抑制關系密切[8]。阻斷淋巴細胞凋亡能明顯延長膿毒癥小鼠的生存期[9]。在調控T淋巴細胞分化中Notch信號通路發揮重要的作用，抑制Notch信號通路能提高膿毒癥小鼠的抗感染能力[10-12]。參附注射液對膿毒癥的免疫調節機制尚未報道，本研究基于Notch信號通路探討參附注射液對膿毒癥的免疫調控作用，為臨床提供數據支持。

1 材料

1.1 動物SPF級C57BL/6雄性小鼠40只，8～10周齡，體質量28～30 g，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。依照本院實驗動物管理辦法，室溫下標準飼料、自由飲水、分籠(4籠)適應性飼養一周后用于實驗。本研究中所有動物實驗操作均經本院實驗動物管理倫理委員會批準，倫理批號：2019-032。

1.2 藥物與試劑參附注射液(雅安三九藥業公司，批號：01811201)。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-10酶聯免疫測定試劑盒(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)(南京建成生物有限公司，批號：NJ1256、NJ60082、NJ00283)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司，批號：G112015)；原位末端標記(TdT-mediated dUTP nick and labeling，TUNEL)試劑盒(美國Trevigen公司，批號：TR25658)；兔抗小鼠Notch1單抗和羊抗小鼠Hes1單抗(美國Invitrogen公司，批號：46-2500、46-1589)。

1.3 儀器LIOOS600T型熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；GelDoc Go型凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；RM2135型組織切片機(德國Leica公司)；20PR-52D型高速冷凍離心機(日本Hitachi公司)；FACS420型流式細胞儀(美國BD公司)。

2 方法

2.1 動物模型構建和分組處理小鼠適應性喂養1周后隨機分為4組，每組10只，即假手術組、模型組、參附注射液低劑量組(5 mL·kg-1)、參附注射液高劑量組(10 mL·kg-1)。除假手術組外，其余各組小鼠采用盲腸結扎穿孔手術制備膿毒癥模型[13]：術前12 h禁食，10%異氟烷腹腔注射將小鼠麻醉后，取仰臥位固定在無菌操作臺上，于腹正中行縱切口2 cm，牽出盲腸，使用4號線結扎盲腸根部，同時使用14G套管針將盲腸貫通穿孔，輕微用力擠出少許大便，確保穿刺空的通暢，使腸管回腹腔，逐層縫合傷口。假手術組小鼠僅暴露盲腸后即進行傷口縫合，其他操作同上。造模后2 h各組給予相應的藥物，每12 h腹腔注射1次，連續4次，假手術組和模型組注射同體積生理鹽水。

2.2 ELISIA法檢測小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10水平采用摘除眼球法收集各組小鼠外周血后，離心，取血清，ELISIA試劑盒檢測小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-10水平。

2.3 計算小鼠脾臟指數取血后，將小鼠以頸椎脫臼法處死，在顯微鏡下準確剝離小鼠脾臟，稱取質量，計算小鼠的脾臟指數。

脾臟指數=脾臟質量/體質量

2.4 HE染色檢測各組小鼠脾臟組織病理學改變每組隨機選擇3只小鼠，取脾臟，置于40 ng·L-1多聚甲醛中固定，按HE染色步驟制作切片，光鏡下觀察小鼠脾臟病理改變。

2.5 TUNEL染色檢測各組小鼠脾臟細胞凋亡取上述HE染色的蠟塊，二甲苯浸洗兩次，梯度乙醇浸洗5 min，風干后用3%雙氧水-甲醇浸泡 10 min，PBS漂洗3次，每次3 min，然后4 ℃預冷乙醇上進行如下操作：0.1%TritonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS漂洗3次，每次3 min，加入TUNNEL反應混合液，加封口膜在暗濕盒中反應1 h，37 ℃ PBS漂洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，熒光顯微鏡觀察小鼠脾臟的細胞凋亡情況。

2.6 流式細胞術檢測各組小鼠脾臟組織中Treg、Th17淋巴細胞的百分比將每組小鼠靜脈血1 mL放入EDTA抗凝管中，加入抗體(FITC抗人IL-17 mAbIgG、FITC 抗人CD25mAb)10 μL，室溫下避光孵育30 min，然后加入200 μL溶血素避光放置 15 min，裂解紅細胞，3 000 r·min-1離心5 min，用PBS重懸后再離心，洗滌2次，沉淀用100 μL 10 ng·L-1多聚甲醛溶液固定，流式細胞儀檢測Treg、Th17細胞百分比。

2.7 Western blot檢測各組小鼠脾臟組織中Notch1、Hes1蛋白表達每組隨機選擇3只小鼠，取脾臟，提取總蛋白，經BCA試劑盒測定蛋白濃度后，變性，取50 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將樣品蛋白轉至PVDF轉膜上，脫脂奶粉封閉后，一抗(11 500)稀釋后，4 ℃ 孵育過夜，洗滌加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的二抗孵育3 h，增強化學發光ELC顯色30 min，經曝光、顯影、定影后，以GAPDH為內參來表示蛋白的表達水平。

3 結果

3.1 參附注射液對小鼠脾臟指數的影響與假手術組比較，模型組小鼠脾臟指數顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，參附注射液低、高劑量組小鼠脾臟指數顯著升高(P<0.05)，且高劑量組變化更明顯。見圖1。

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖1 各組小鼠脾臟指數的比較

3.2 參附注射液對小鼠脾臟組織病理學改變的影響假手術組小鼠脾臟表面有光澤，結構完整，紅髓、白髓界限清晰，脾小體形態和數量正常，脾小結性狀正常，淋巴細胞未見有明顯的分化分裂現象，細胞分布致密；模型組小鼠脾臟腫脹明顯，體積變大，脾臟結構破壞明顯，紅髓、白髓分界不清，紅髓縮小，白髓區域擴張，濾泡增加，結締組織增加，脾小體數量明顯減少，脾小結不同程度腫脹，淋巴細胞排列稀疏；參附注射液低、高劑量組小鼠脾臟可見清晰的白髓、紅髓以及邊緣區，脾小體數量、淋巴細胞數量有所增加，脾臟病理變化均有所改善，且高劑量組改善更明顯。見圖2。

注：A：假手術組；B：模型組：C：參附注射液低劑量組；D：參附注射液高劑量組圖2 觀察各組小鼠的脾臟組織病理損傷改變(HE染色，×200)

3.3 參附注射液對小鼠脾臟細胞凋亡的影響與假手術組比較，模型組小鼠脾臟細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，參附注射液低、高劑量組小鼠脾臟細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，且高劑量組變化更明顯。見圖3。

3.4 參附注射液對小鼠脾臟Th17、Treg淋巴百分比的影響與假手術組比較，模型組小鼠脾臟Th17淋巴細胞百分比顯著升高，Treg淋巴細胞百分比顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，參附注射液低、高劑量組小鼠脾臟Th17淋巴細胞百分比顯著降低，Treg淋巴細胞百分比顯著升高(P<0.05)，且高劑量組變化更明顯，說明參附注射液可明顯改善膿毒癥小鼠Th17、Treg淋巴細胞百分比，維持免疫調節功能的平衡。見圖4。

注：A：假手術組；B：模型組；C：參附注射液低劑量組；D：參附注射液高劑量組。與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖3 TUNEL染色檢測小鼠脾臟組織中細胞的凋亡(×400)

注：A：假手術組；B：模型組；C：參附注射液低劑量組；D：參附注射液高劑量組。與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖4 各組小鼠脾臟Th17、Treg淋巴細胞百分比

3.5 參附注射液對小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10水平的影響與假手術組比較，模型組小鼠血清中IL-17、TNF-α水平顯著升高，IL-10水平顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，參附注射液低、高劑量組小鼠血清IL-17、TNF-α水平顯著下降，IL-10水平顯著升高(P<0.05)，且高劑量組變化更明顯。見圖5。

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖5 檢測各組小鼠血清中IL-17、IL-10和TNF-α水平

3.6 參附注射液對小鼠脾臟Notch1、Hes1蛋白表達的影響與假手術組比較，模型組小鼠脾臟Notch1、Hes1蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，參附注射液低、高劑量組小鼠脾臟Notch1、Hes1蛋白表達顯著降低(P<0.05)，且高劑量組變化更明顯。見圖6。

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖6 Western blot檢測各組小鼠胸脾臟組織中Notch1和Hes1蛋白的表達

4 討論

膿毒癥是一種與免疫抑制緊密相關的危及生命的器官功能障礙綜合癥。該病常見于外科術后、創傷以及免疫低下等，細菌引起的全身性嚴重感染，如不能有效的控制感染，可進一步演變為膿毒癥休克或多器官衰竭綜合癥，導致患者失去生命[14-15]。膿毒癥臨床發病多以虛實夾雜或虛證為主，邪氣耗氣傷陰，失治誤治又犯“虛虛實實”之弊。抗生素苦寒，往往傷陽或加重陽虛之勢，甚者形成虛陽外越、陽氣欲脫之勢[16-18]。參附注射液是根據中醫古方參附湯演化而來，參附湯是益氣溫陽、扶正固本的代表方，且在臨床應用取得了良好的效果。有學者認為，膿毒癥誘發的免疫抑制甚或免疫麻痹狀態所產生的反應即是機體處于正虛無力抗邪的急性虛證狀態，此期主要的病機為“邪毒熾盛，正氣已虛”[19]。

免疫系統是包括器官、組織、細胞和效應分子的綜合復雜系統，其中脾臟是關鍵的外周免疫器官，也是機體最大的淋巴器官，免疫器官的臟器指數是衡量免疫系統臟器是否受損的初步指標[20]。本研究中模型組小鼠脾臟指數顯著低于假手術組，經過參附注射液治療后，脾臟指數顯著升高，說明參附注射液能夠修復免疫系統臟器損傷。研究發現，參附注射液能夠調節膿毒癥小鼠的免疫系統，抑制炎性反應，減輕器官損傷[21]。T細胞是機體細胞免疫的主要效應細胞，主要介導機體對寄生病原體以及腫瘤細胞的清除[22]。研究表明，膿毒癥應激過程中脾臟可受到不同程度的損傷，導致T淋巴細胞功能受限，出現免疫抑制[23]。Th17和Treg細胞屬于CD4+T細胞亞群，二者在生理功能上相互制約，共同參與調節機體免疫反應[24]。當機體處于穩態時，T細胞趨于向Treg細胞方向分化；當發生炎癥反應或感染時，免疫系統被激活，T細胞向Th17細胞分化，發生自身免疫性疾病[24]。Treg細胞與其他CD4+T細胞不同，是一類具有抑制炎癥反應作用的細胞，可提高外周血Treg淋巴細胞的水平、減輕腎損傷[25]。嚴重膿毒癥患者使用參附注射液后，能明顯改善T細胞亞群，有助于維持免疫炎癥調節功能的平衡[26]。

Th17/TregT細胞亞群對機體起免疫平衡調節作用，通過分泌IL-17、TNF-α、IL-10等細胞因子，抑制巨噬細胞、Th細胞釋放促炎因子，從而抑制炎癥反應[27]。本研究中模型組小鼠脾臟IL-10水平及Treg細胞百分比均顯著低于假手術組，而 IL-17、TNF-α及Th17細胞百分比明顯高于假手術組，提示膿毒癥加劇了Th17和Treg細胞平衡向Th17轉化，參與全身炎癥反應，而參附注射液可能通過恢復膿毒癥小鼠脾臟Th17/TregT細胞亞群介導的免疫平衡，達到治療的目的。

Notch信號通路是T細胞分化、增殖和活化的重要通路，在多種免疫疾病中發揮重要作用。在成熟的免疫細胞表面均有Notch受體的表達，Notch是一種單次跨膜受體蛋白，通過細胞間相互作用可活化下游靶基因hes，影響T細胞的生理功能，特別是在Th17/Treg細胞分化中作用最為顯著[28]。研究發現，肺炎小鼠Th17細胞百分比及Th17/Treg明顯升高，同時Notch蛋白表達明顯上調[29-31]。本研究結果顯示，參附注射液低、高劑量組小鼠脾臟組織中Notch1、Hes1蛋白表達明顯下調，表明參附注射液可能通過Notch信號通路調節Th17/Treg免疫平衡參與膿毒癥的進展。

綜上所述，參附注射液可以減輕膿毒癥模型小鼠脾臟功能損傷，可能是通過Notch信號通路調節Th17/Treg免疫平衡，從而改善膿毒癥的免疫抑制。