藏紅花素對癲癇模型大鼠海馬神經元的保護作用*

江冉冉，陳麗霞，周蓓瀛

華北醫療健康集團峰峰總醫院，河北 邯鄲 056200

癲癇(epilepsy，EP)是一種常見的慢性神經系統疾病，以感覺、意識、精神、行為等功能性障礙為主要臨床表現，具有反復、急性自發的特點，嚴重影響患者的身心健康。EP發作是大腦神經元過度興奮和同步異常放電所致，該過程導致神經元損傷或丟失使EP病情進行性加重[1-2]。EP發病機制十分復雜，其中氧化應激和細胞凋亡是重要作用機制[3]。藏紅花素(又名西紅花苷)為中藥藏紅花的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡等作用[4-5]。研究發現，藏紅花素能夠通過抑制氧化應激和細胞凋亡對缺血性腦損傷起到保護作用[6]，但是否對EP所致腦組織損傷具有保護作用，尚未見文獻報道。本研究探討藏紅花素對EP模型大鼠海馬神經元的保護作用。

1 材料

1.1 動物清潔級SD大鼠120只，雄性，7周齡，體質量230～250 g，購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀)2018-004。飼養條件：光照黑暗各12 h交替、室溫23～25 ℃、相對濕度55%～65%。本研究經華北醫療健康集團峰峰總醫院倫理委員會審核批準，倫理批號：HBYLLL[K]字2020-017。

1.2 藥物與試劑藏紅花素(純度≥98%，美國Sigma公司，批號：17304-1G)；注射用丙戊酸鈉(四川科瑞德制藥股份有限公司，批號：20190826)。TUNEL染色試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：200319、200105、200422、200307)；核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 correlation factor 2，Nrf2)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、激活型半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)抗體和β-actin抗體(北京博奧森生物技術有限公司，貨號：bs-1074R、bs-2075R、bs-23217R、bs-0081R、bs-0061R)；氯化鋰(北京索萊寶科技有限公司，貨號：C8380)；匹羅卡品(上海阿拉丁試劑有限公司，貨號：P129614)；水合氯醛(北京化學試劑廠，批號：191128)；40 ng·L-1多聚甲醛(天津科密歐化學試劑有限公司，批號：20180914)。

1.3 儀器RM2125型石蠟切片機(德國Leica公司)；CKX31型倒置光學顯微鏡(日本Olympus公司)；UV762型紫外-可見分光光度計(上海楚定分析儀器有限公司)；SE300型電泳儀、TE22型轉膜儀(美國Hoefer公司)；EC3 410型化學發光成像系統(美國UVPN公司)。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備與給藥將120只大鼠按照隨機數字表法分為空白對照組、模型組、藏紅花素(低、中、高劑量)組(5 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1)[7]及丙戊酸鈉組(300 mg·kg-1)[8]，每組20只。除空白對照組外，其余各組均采用氯化鋰-匹羅卡品化學點燃法制備EP大鼠模型[9]：腹腔注射氯化鋰溶液(127 mg·kg-1)，20 h后背部皮下注射匹羅卡品溶液(15 mg·kg-1)，丙戊酸鈉組和藏紅花素各劑量組均在注射匹羅卡品前30 min腹腔注射給予相應劑量藥物1次(模型組給予生理鹽水)；空白對照組各步驟均同步給予生理鹽水。

2.2 EP模型大鼠首次發作潛伏期、持續時間及發作程度分級匹羅卡品注射后2 h內觀察并記錄各組大鼠EP首次發作潛伏期和持續時間，對照Racine分級標準對EP發作程度進行分級[10]：無發作為0級；口周及面部肌肉抽搐為1級；點頭或頻繁抖動為2級；前肢局限性陣攣為3級；前肢局限性陣攣伴后肢站立的全身強直性發作為4級；前肢局限性陣攣伴有站立并摔倒、翻滾的全身強直陣攣發作為5級。

2.3 HE染色觀察大鼠海馬神經元病理學變化給藥結束后隨機取各組大鼠10只，腹腔注射體積分數10%水合氯醛溶液(3 mL·kg-1)麻醉，頸椎脫臼處死，斷頭取腦，去除小腦、腦干后置于40 ng·L-1多聚甲醛溶液固定72 h，石蠟包埋、5 μm厚度切片、梯度乙醇脫蠟和二甲苯透明，行HE染色，通過光學顯微鏡觀察大鼠海馬神經元病理學改變。

2.4 TUNEL法觀察海馬神經元凋亡水平取“2.3”項下制備的各組大鼠的腦組織石蠟切片，經梯度乙醇脫蠟和二甲苯透明后，按照TUNEL試劑盒操作說明進行染色處理，封片后通過光學顯微鏡觀察大鼠海馬神經元凋亡狀態；凋亡指數(apoptosis index，AI)計算：每只大鼠選取同部位5張染色切片，每張切片選取5個不重疊視野計數凋亡細胞數和細胞總數，取平均值。

AI(%)=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%

2.5 檢測大鼠海馬組織MDA、SOD、CAT活性分別取各組剩余的10只大鼠，麻醉后脊椎脫臼處死，在冰上斷頭取腦并剝取海馬組織，加入適量裂解液后研磨勻漿，4 ℃、3 000 r·min-1離心(離心半徑10 cm)10 min，取上清液，然后按試劑盒操作方法進行處理，通過紫外-可見分光光度計檢測大鼠海馬組織MDA、SOD、CAT活性。

2.6 Western blot法檢測大鼠海馬組織蛋白表達取“2.5”項下制備的各組10只大鼠的海馬組織勻漿液，4 ℃、12 000 r·min-1離心(離心半徑 10 cm)25 min 取沉淀，通過BCA法檢測蛋白總濃度后，95 ℃水浴使蛋白變性，30 μg蛋白量上樣、SDS-PAGE膠電泳、濕法轉PVDF膜、5%脫脂奶粉37 ℃封閉 1 h 后，滴加目標蛋白和β-actin一抗后，4 ℃孵育過夜，洗膜后滴加IgG二抗室溫孵育 1 h，洗膜后滴加DAB顯色，以β-actin為內參半定量目標蛋白表達。

3 結果

3.1 藏紅花素對EP模型大鼠首次發作潛伏期、持續時間及發作程度的影響與模型組比較，藏紅花素中、高劑量組和丙戊酸鈉組大鼠首次EP發作潛伏期極顯著延長、發作持續時間極顯著縮短、發作程度分級極顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 藏紅花素對EP大鼠首次發作潛伏期、持續時間及發作程度的影響

3.2 藏紅花素對EP模型大鼠海馬神經元病理學改變的影響空白對照組大鼠海馬神經元呈圓形或橢圓形，排列整齊，核膜、核仁邊界清晰；模型組大鼠海馬神經元可見形態不規則、排列紊亂、層次不清、核膜不清，核仁固縮、偏移、深染等形態結構改變；藏紅花素低、中、高劑量組和丙戊酸鈉組大鼠海馬神經元形態較規則、排列較整齊、核膜核仁邊界清晰，其中高劑量組改善最明顯。見圖1。

注：A：空白對照組；B：模型組；C：藏紅花素低劑量組；D：藏紅花素中劑量組；E：藏紅花素高劑量組；F：丙戊酸鈉組圖1 藏紅花素對EP模型大鼠海馬神經元病理學改變的影響(HE染色，×400)

3.3 藏紅花素對EP模型大鼠海馬神經元凋亡的影響與空白對照組比較，模型組大鼠海馬神經元凋亡數量明顯增多，AI極顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，藏紅花素中、高劑量組和丙戊酸鈉組大鼠海馬神經元凋亡數量明顯減少，AI極顯著降低(P<0.01)。見圖2、表2。

表2 藏紅花素對EP模型大鼠海馬組織神經元凋亡的影響

注：A：空白對照組；B：模型組；C：藏紅花素低劑量組；D：藏紅花素中劑量組；E：藏紅花素高劑量組；F：丙戊酸鈉組圖2 藏紅花素對EP模型大鼠海馬神經元凋亡的影響(×400)

3.4 藏紅花素對EP模型大鼠海馬組織MDA、SOD、CAT活性的影響與空白對照組比較，模型組大鼠海馬組織MDA活性極顯著升高(P<0.01)，SOD、CAT活性極顯著降低(P<0.01)；與較模型組比較，藏紅花素中、高劑量組和丙戊酸鈉組大鼠海馬組織MDA活性極顯著降低(P<0.01)，SOD、CAT活性極顯著升高(P<0.01)。見表3。

表3 藏紅花素對EP模型大鼠海馬組織MDA、SOD、CAT活性的影響

3.5 藏紅花素對EP模型大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響與空白對照組比較，模型組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達極顯著降低(P<0.01)，NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表達極顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，藏紅花素中、高劑量組和丙戊酸鈉組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達極顯著升高(P<0.01)，NF-κB、Cleaved Caspase-3 蛋白表達極顯著降低(P<0.01)。見圖3，表4。

注：A：空白對照組；B：模型組；C：藏紅花素低劑量組；D：藏紅花素中劑量組；E：藏紅花素高劑量組；F：丙戊酸鈉組圖3 藏紅花素對EP模型大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響

表4 藏紅花素對EP模型大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響

4 討論

EP是全球范圍內重點防治的神經系統疾病，我國EP患者約900萬，每年新發病例約45萬，發病率(25～35)/10萬。研究顯示，EP患者突發死亡風險是普通人群的3倍[11-12]。病理生理學研究發現，神經元過度興奮和同步異常放電導致活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量生成與蓄積，引發氧化應激和繼發性細胞凋亡，是EP發作和神經元退行性病變的核心環節[3]。因此，研究靶向抑制氧化應激和細胞凋亡的新型藥物可能是抑制EP發作并改善其預后的有效途徑。

藏紅花(又名番紅花)是一種鳶尾科番紅花屬多年生花卉，味甘、性平，具有活血化瘀、散郁開結的功效。藏紅花素是藏紅花的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡活性，較易通過血腦屏障。研究發現，藏紅花素通過抑制氧化應激反應和神經元凋亡減輕大鼠缺血性腦損傷[6]。丙戊酸鈉是一種廣泛應用于臨床的廣譜抗EP藥，也是EP相關實驗研究的常用陽性對照藥物。EP動物模型的制備方法主要有電點燃和化學點燃兩大類，其中氯化鋰-匹羅卡品化學點燃法制備的EP大鼠模型病理特征與人類高度相似，且操作簡便、重復性高，是目前公認的EP大鼠模型制備方法[13]。本實驗采用氯化鋰-匹羅卡品法制備EP大鼠模型，并以丙戊酸鈉為陽性對照藥物，經藏紅花素預處理能夠顯著延長EP發作潛伏期、縮短發作持續時間、降低EP發作程度，明顯改善大鼠海馬神經元病變并抑制神經元細胞凋亡，且藏紅花素高劑量組效果優于丙戊酸鈉組，提示藏紅花素對EP模型大鼠具有海馬神經元保護作用。

ROS過剩是發生氧化應激反應的物質基礎，EP發作時大腦神經元過度興奮和異常放電導致ROS大量生成，抗氧化酶(SOD、CAT)被過度消耗，導致ROS代謝失衡而蓄積[14-16]；過剩的ROS破壞核酸、蛋白質及生物膜脂質等分子結構，生成具有生物毒性的MDA。因此，MDA、SOD、CAT活性能夠反映機體氧化應激程度[17]。研究發現，抑制氧化應激損傷能夠有效降低EP模型大鼠海馬神經元損傷[18-19]。本研究結果發現，經藏紅花素預處理EP模型大鼠可顯著降低海馬組織MDA活性，升高SOD、CAT活性，且藏紅花素高劑量組效果最佳，提示藏紅花素對EP模型大鼠海馬神經元氧化應激損傷具有抑制作用。

Nrf2是真核細胞中普遍存在的一種核轉錄因子，生理狀態下Nrf2與其特異性酶抑制劑Keap1結合而無活性，ROS能夠刺激Nrf2與Keap1解離而活化，游離的Nrf2核轉位后與抗氧化反應原件(antioxidant response element，ARE)結合，促進抗氧化酶(包括SOD、CAT)轉錄與表達[20-22]。HO-1通過催化降解血紅素、清除CO等抑制氧化應激反應，而HO-1是Nrf2的下游基因，Nrf2核轉位后能夠誘導HO-1轉錄表達[23-25]。Cleved Caspase-3參與細胞凋亡的啟動與執行全過程，是細胞凋亡最關鍵的調控因子[26-28]。研究發現，NF-κB能夠誘導Caspase-3的活化[29]；HO-1能夠通過抑制 NF-κB 啟動子IKKβ磷酸化而抑制NF-κB活性[30]。本研究結果顯示，經藏紅花素預處理EP模型大鼠可顯著升高海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達，降低NF-κB、Cleaved Caspase-3表達，且藏紅花素高劑量組效果優于丙戊酸鈉組，提示藏紅花素對EP模型大鼠氧化應激和細胞凋亡的抑制作用可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關。

綜上所述，藏紅花素對EP模型大鼠具有抗癲癇和海馬神經元保護作用，可能與激活Nrf2/HO-1信號通路進而抑制氧化應激和細胞凋亡有關。