華蟾素通過IGF-1R信號通路對肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響*

楊建波，劉鵬，張文興，陳青山，鄧芳芳

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

肝癌是常見的一種全球性實(shí)體惡性腫瘤[1]，具有極高的發(fā)病率以及病死率，對人類的生命健康具有嚴(yán)重的影響[2]，一般會有肝區(qū)疼痛、腹水、乏力等癥狀[3]。通常情況下，肝癌有手術(shù)、冷凍、化療等治療方式[5]，但由于化療對其作用不明顯，有效率較低，同時有不良反應(yīng)[6]，因此，尋求新的抗癌中藥至關(guān)重要。華蟾素注射液是一種具有抗腫瘤作用的中藥注射液[7]，是從中華大蟾蜍皮中提取加工出來的，具有清熱解毒、活血化瘀等功效[8]，可抑制腫瘤細(xì)胞生長，提高機(jī)體免疫功能，在肺癌、皮膚癌、胃癌等疾病中已有應(yīng)用[9]。本研究主要探討其對肝癌細(xì)胞的效用。

1 材料

1.1 細(xì)胞人肝癌HepG2細(xì)胞株(江陰雨汐生物科技有限公司，貨號：YX-005)。

1.2 藥物與試劑華蟾素注射液(安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司，批號：Z34020273)。胎牛血清(江蘇依萊薩生物技術(shù)有限公司，批號：12676-029)；DMEM高糖培養(yǎng)基(北京科美生物技術(shù)有限公司，批號：12100046)；BCA蛋白定量試劑盒(上海賽默飛生物科技有限公司，批號：23221-23230)；SDS-PAGE試劑盒(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，貨號：SJH0899)；PBS緩沖液(上海源葉生物科技有限公司，貨號：R22379)；PVDF膜(上海易勵醫(yī)療器械有限公司，批號：10600023)；緩沖液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號：B1009-TBST)；EGF-1R、ERK、Akt一抗(美國CST公司，貨號：2366T、2305T、2314T)；羊抗鼠二抗(廣州天駿生物科技有限公司，貨號：A11001)；CCK-8試劑(北京富龍康泰生物技術(shù)有限公司，貨號：FP-M-300)；Transwell小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司，貨號：3422)。

1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱(上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司，型號：H3-6815-02)；生物安全柜(北京東南儀誠實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司，型號：BSC-1360A2)；通用離心機(jī)(深圳諸夏科技有限公司，型號：Sorvall ST 8)；酶標(biāo)儀(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司，型號：BIOBASE-EL10B)；烘箱(北京賽歐華創(chuàng)科技有限公司，型號：DHG-9140A)；光學(xué)顯微鏡(博亞捷晶科技(北京)有限公司，型號：XTL)；高速組織搗碎機(jī)(昆明佰奧勒生物科技有限公司，型號：JX-2008)；電泳儀(北京六-儀器廠，型號：DYY-8C)；電泳槽(北京六儀器廠，型號：DYCZ-24D)；轉(zhuǎn)印槽(北京六儀器廠，型號：DYCZ-40D)；低溫高速離心機(jī)(湖南湘儀公司，型號：H2050R)；超低溫冰箱(美國FORMA公司，型號：702)；分光光度計(jì)(上海分析儀器總廠，型號：721)；脫色搖床(上海琪特分析儀器有限公司，型號：STS-2)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將人肝癌HepG2細(xì)胞在DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的孵育箱中，當(dāng)細(xì)胞生長到融合度約80%左右后，用體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶處理1 min，消化傳代培養(yǎng)，2 d進(jìn)行一次培養(yǎng)基更換。

2.2 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞用胰酶消化后，接種100 μL培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液(每孔含2×103個細(xì)胞)于96孔板中，加入不同濃度華蟾素注射液(0.420 mg·L-1、0.210 mg·L-1、0.105 mg·L-1及0.053 mg·L-1)，100 μL培養(yǎng)基(含細(xì)胞及不含細(xì)胞)作為空白對照組，空白組每組設(shè)置3個復(fù)孔，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育適當(dāng)時間(0 h、24 h、48 h)，向待測的培養(yǎng)板中每孔加入10 μL CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱中孵育2 h，取出培養(yǎng)板用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(OD)，并計(jì)算每組3個復(fù)孔的平均值，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(給藥組OD值-空白對照組OD值)/(空白對照組OD值-空白組OD值)×100%。

2.3 Transwell法檢測肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，接種不同濃度華蟾素注射液(0.420 mg·L-1、0.210 mg·L-1、0.105 mg·L-1及0.053 mg·L-1)，設(shè)0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.210 mg·L-1華蟾素注射液組、0.105 mg·L-1華蟾素注射液組、0.053 mg·L-1華蟾素注射液組，另設(shè)空白對照組，胰蛋白酶消化HepG2細(xì)胞后，進(jìn)行細(xì)胞的收集，然后重懸細(xì)胞。Transwell上室的每孔中加入細(xì)胞懸液(200 μL)，下室的每孔中加入培養(yǎng)液(600 μL、含10% FBS)。置于培養(yǎng)箱中(37 ℃、5%CO2)孵育48 h，除去上室培養(yǎng)液，加入甲醛溶液(0.79 g·mL-1)，固定20 min。除去甲醛，結(jié)晶紫染色20 min，洗滌后置于烘箱中干燥，重復(fù)3次后，于光學(xué)顯微鏡下觀察，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)分析肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

2.4 Western blot法檢測細(xì)胞IGF-1R信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，接種不同濃度華蟾素注射液(0.420 mg·L-1、0.210 mg·L-1，0.105 mg·L-1及0.053 mg·L-1)，設(shè)為0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.21 mg·L-1華蟾素注射液組、0.105 mg·L-1華蟾素注射液組、0.053 mg·L-1華蟾素注射液組，另設(shè)空白對照組，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌后，加入細(xì)胞裂解液裂解5 min后，于3 000 r·min-1，-4 ℃下進(jìn)行離心，取上清液，以BCA 法測定蛋白總量。然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，加入脫脂奶粉(5%)，密封1 h，TBST洗滌后加入一抗(稀釋比例11 000)，4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌后，添加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，洗滌后加顯色劑顯影，每組重復(fù)3次。用凝膠成像軟件進(jìn)行分析，計(jì)算IGF-1R、Akt、ERK的蛋白表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 華蟾素對肝癌細(xì)胞增殖的影響與空白對照組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.210 mg·L-1華蟾素注射液組、0.105 mg·L-1華蟾素注射液組、0.053 mg·L-1華蟾素注射液組12 h、24 h、48 h細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與0.053 mg·L-1華蟾素注射液組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.210 mg·L-1華蟾素注射液組、0.105 mg·L-1華蟾素注射液組12 h、24 h、48 h細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與0.105 mg·L-1華蟾素注射液組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.210 mg·L-1華蟾素注射液組12 h、24 h、48 h細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與0.210 mg·L-1華蟾素注射液組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組12 h、24 h、48 h細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 華蟾素對肝癌細(xì)胞增殖的影響

3.2 華蟾素對肝癌細(xì)胞遷移的影響與空白對照組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.210 mg·L-1華蟾素注射液組、0.105 mg·L-1華蟾素注射液組、0.053 mg·L-1華蟾素注射液組細(xì)胞遷移能力顯著降低(P<0.05)；與0.053 mg·L-1華蟾素注射液組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.210 mg·L-1華蟾素注射液組、0.105 mg·L-1華蟾素注射液組細(xì)胞遷移能力顯著降低(P<0.05)；與0.105 mg·L-1華蟾素注射液組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.210 mg·L-1華蟾素注射液組細(xì)胞遷移能力顯著降低(P<0.05)；與0.210 mg·L-1華蟾素注射液組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組細(xì)胞遷移能力顯著降低(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 華蟾素對肝癌細(xì)胞遷移的影響

注：A：0.420 mg·L-1華蟾素注射液組；B：0.210 mg·L-1華蟾素注射液組；C：0.105 mg·L-1華蟾素注射液組；D：0.053 mg·L-1華蟾素注液組；E：空白對照組圖1 華蟾素注射液對肝癌細(xì)胞遷移的影響(×100)

3.3 華蟾素對肝癌細(xì)胞侵襲的影響與空白對照組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.210 mg·L-1華蟾素注射液組、0.105 mg·L-1華蟾素注射液組、0.053 mg·L-1華蟾素注射液組細(xì)胞侵襲能力顯著降低(P<0.05)；與0.053 mg·L-1華蟾素注射液組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.210 mg·L-1華蟾素注射液組、0.105 mg·L-1華蟾素注射液組細(xì)胞侵襲能力顯著降低(P<0.05)；與0.105 mg·L-1華蟾素注射液組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.210 mg·L-1華蟾素注射液組細(xì)胞侵襲能力顯著降低(P<0.05)；與0.210 mg·L-1華蟾素注射液組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組細(xì)胞侵襲能力顯著降低(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 華蟾素對肝癌細(xì)胞侵襲的影響

注：A：0.420 mg·L-1華蟾素注射液組；B：0.210 mg·L-1華蟾素注射液組；C：0.105 mg·L-1華蟾素注射液組；D：0.053 mg·L-1華蟾素注液組；E：空白對照組圖2 華蟾素注射液對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響(×100)

3.4 各組細(xì)胞中IGF-1R信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況與空白對照組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.210 mg·L-1華蟾素注射液組、0.105 mg·L-1華蟾素注射液組、0.053 mg·L-1華蟾素注射液組細(xì)胞IGF-1R、Akt、ERK蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；與0.053 mg·L-1華蟾素注射液組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.210 mg·L-1華蟾素注射液組、0.105 mg·L-1華蟾素注射液組細(xì)胞IGF-1R、Akt、ERK蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；與0.105 mg·L-1華蟾素注射液組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組、0.210 mg·L-1華蟾素注射液組細(xì)胞IGF-1R、Akt、ERK蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；與0.210 mg·L-1華蟾素注射液組比較，0.420 mg·L-1華蟾素注射液組細(xì)胞IGF-1R、Akt、ERK蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 各組細(xì)胞IGF-1R、Akt、ERK蛋白表達(dá)

注：A：0.420 mg·L-1華蟾素注射液組；B：0.210 mg·L-1華蟾素注射液組；C：0.105 mg·L-1華蟾素注射液組；D：0.053 mg·L-1華蟾素注射液組；E：空白對照組圖3 各組細(xì)胞中IGF-1R信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

4 討論

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，飲水污染、亞硝胺類物質(zhì)、黃曲霉素等都可能是其發(fā)生的原因[10]。肝癌在臨床上具有進(jìn)展迅速、病程短、中晚期生存期短等特點(diǎn)[11]，由于其確診的延誤性，往往會錯失良好的手術(shù)機(jī)會[12]。肝癌對化療藥物不敏感，所以其治療效果較差，而靶向藥物對肝癌的治療現(xiàn)狀也未有改善[13]。華蟾素注射液是一種抗腫瘤類的重要注射液，主要來源為中華大蟾蜍皮，其中有吲哚生物堿、蟾毒靈以及脂蟾毒配基等成分[14]，具有止痛、抗病毒、促進(jìn)骨髓增生等藥理作用，還具有保護(hù)肝臟、抗腫瘤及提高機(jī)體免疫力等作用[15]。因此，本研究探討華蟾素對肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。

本實(shí)驗(yàn)以人肝癌HepG2細(xì)胞株為研究對象，培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞將其分為不同濃度華蟾素注射液組(0.420 mg·L-1、0.210 mg·L-1、0.105 mg·L-1、0.053 mg·L-1)及空白對照組。本研究結(jié)果表明，與空白對照組比較，不同濃度華蟾素注射液組肝癌細(xì)胞增殖抑制率增加，且華蟾素注射液作用時間越長、濃度越高，其對肝癌細(xì)胞增殖抑制率就越強(qiáng)。研究表明，華蟾素可抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16-17]，本實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞遷移及侵襲情況發(fā)現(xiàn)，華蟾素能夠抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，且其作用時間越長、濃度越高，對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用越明顯。研究表明，華蟾素可以通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶抑制人胃腺癌細(xì)胞MGC-803侵襲與遷移[18]；通過對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲等的檢測發(fā)現(xiàn)，華蟾素可降低細(xì)胞的增殖侵襲等能力[19]，這與本研究的結(jié)果相一致。

IGF-1R信號通路的異?；顒油喾N腫瘤的發(fā)生進(jìn)展以及耐藥性緊密相關(guān)[20-22]。IGF-1R是一種胰島素生長因子，是α2β2亞單位的四聚體，可同IGF結(jié)合[23-25]，其中α及β亞基皆由單個的mRNA 前體合成，經(jīng)歷糖基化、蛋白水解切割等步驟后，與半胱氨酸鍵交聯(lián)最終形成功能性跨膜α-β復(fù)合鏈[26]，在腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲以及耐藥過程中發(fā)揮重要作用[27-29]。華蟾素對骨癌痛具有緩解作用，對炎性因子的釋放、脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活具有抑制作用[30]，還可抑制CCL2/CCR2途徑的激活。本研究通過Western Blot法檢測IGF-1R信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，不同濃度華蟾素注射液組細(xì)胞IGF-1R、Akt、ERK蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，提示華蟾素可能對IGF-1R信號通路有影響，且隨著濃度的增加具有更強(qiáng)的抑制作用。提示華蟾素注射液可能是對IGF-1R信號通路產(chǎn)生作用，從而實(shí)現(xiàn)對肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制。

綜上，華蟾素可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲能力，其作用可能與抑制IGF-1R信號通路有關(guān)，這為肝癌治療提供一個新思路。本研究也存在一定的局限性，本文是通過體外實(shí)驗(yàn)探索華蟾素對肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，若要將華蟾素應(yīng)用于臨床治療還需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。