益髓方改善胃癌小鼠化療后骨髓抑制機制研究*

黃春風，楊先玉，鄭慧華，劉大毛，陳盼敏，喻敏，王征

1.江西中醫藥大學附屬醫院，江西 宜春 330000； 2.江西中醫藥大學第二附屬醫院，江西 南昌 336000； 3.上饒市人民醫院，江西 上饒 334000

目前，胃癌是發病率排名第四位的癌癥，而化療是其主要治療手段[1-3]。雖然化療在惡性腫瘤的前期治療中發揮較為顯著的作用，但90%以上的化療藥物會對患者造成不同程度的骨髓抑制，嚴重影響患者的生存質量，因此，骨髓抑制成為癌癥治療的最大障礙[4]。針對化療后的骨髓抑制現象，臨床上主要通過使用重組人粒細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)、促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)及造血干細胞移植等方法進行治療，雖然效果顯著，但治療費用昂貴，且反復注射rhG-CSF可能會加重骨髓衰竭[5]。因此，尋找改善化療后骨髓抑制的藥物和療法至關重要。隨著中醫藥現代化的推進，中醫藥防治化療后骨髓抑制的研究逐漸深入。研究顯示，中藥可通過益氣養血、滋補腎精的功效提高骨髓造血功能、增強免疫的作用[6-7]。益髓方是健脾補血、補腎益髓的代表中藥方劑。研究證明，益髓方對胃癌晚期患者化療后的骨髓抑制具有良好的改善作用，能明顯改善貧血等臨床癥狀，提高患者生存質量[8]，但其具體作用機制尚不清晰。Notch信號通路是一類癌癥相關信號通路，抑制Notch信號通路的激活可抑制胃癌細胞的增殖和轉移[9-10]。研究發現，Notch信號通路某些關鍵基因的表達改變可能與骨髓抑制密切相關，其過度活化或抑制均可對骨髓造血活動產生影響[11-12]。本研究構建胃癌小鼠化療后骨髓抑制模型，以Notch信號通路為切入點，觀察益髓方對該模型小鼠的改善作用，并初步探究其作用機制，為益髓方治療化療后骨髓抑制提供臨床理論依據。

1 材料

1.1 動物和細胞50只SPF級BALB/c小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質量(20±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0008。實驗動物飼養在室溫(22±2) ℃、濕度(50±10)%的環境中，保持12 h光照/12 黑暗，自由飲食、飲水。研究方案獲江西中醫藥大學附屬醫院倫理委員會批準，倫理批號：JXZYYDXFSYY20190726。

小鼠胃癌細胞(mouse forestomach carcinoma，MFC)購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，目錄號：1101MOU-PUMC000143。

1.2 藥物與試劑益髓方(龜甲50 g、黃芪20 g、黨參20 g、白術20 g、黃精30 g、菟絲子30 g、雞血藤 30 g、枸杞15 g、紫珠草30 g、仙鶴草30 g、花生衣 30 g、大棗6 g，康美藥業股份有限公司，批號：200310181、19111002、190410120、190910819、200118013、190708121、200510122、191210092、191210103、190612108、200209101、191108032)；重組人粒細胞刺激因子注射液[吉粒芬，杭州九源基因工程有限公司，規格：0.3 mL(75 μg)，國藥準字：S10980030]；注射用環磷酰胺(cyclophosphamide，CTX，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字：H32020857)。瑞氏-吉姆薩復合染液、碘化丙啶(propidium iodide，PI)、ECL超敏發光液、脫脂奶粉、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1020、P8080、PE0010、D8340、PC0020)；白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-3、血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、EPO、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，貨號：E-EL-R0896c、E-EL-M0733c、E-EL-R0963c、E-EL-R0007c、E-EL-R0008c)；Jag1一抗、Notch2一抗、GAPDH一抗及羊抗兔二抗(美國CST公司，貨號：70109、5732、5174、6990)；Numb1一抗、Numb2一抗[艾博抗(上海)貿易有限公司，貨號：ab4147、ab155415]；FITC 倉鼠抗小鼠CD3抗體、PE 大鼠抗小鼠CD4抗體、PerCP 大鼠抗小鼠CD8抗體(美國BD Pharmingen公司，貨號：2136674、5090951、5100992)。

1.3 儀器1703935型轉印電泳儀、1645050型電泳儀電源、1658001型垂直電泳儀、ChemiDoc MP型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；BC-30Vet型全自動血液細胞分析儀(邁瑞醫療國際股份有限公司)；FlexA-200型全波長酶標分析儀(杭州奧盛儀器有限公司)；TGL-20M型臺式高速離心機(湖南滬康離心機有限公司，離心半徑：12.5 cm)；AE2000型倒置顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備取益髓方組方中藥，蒸餾水浸泡 2 h 后，煎煮3次，每次30 min，紗布過濾，合并濾液，濃縮至2 kg·L-1(即每升含生藥量為2 kg)，分裝后儲存于4 ℃冰箱備用。

2.2 動物分組、造模與給藥將50只BALB/c小鼠隨機分為5組，即正常組、模型組、吉粒芬組、益髓方組及吉粒芬+益髓方組，每組10只。除空白組外，其余組小鼠皮下接種密度為1×107mL-1的 MFC細胞建立胃癌荷瘤模型，每只小鼠注射 0.2 mL。當腋下腫瘤體積≥200 mm3且無破潰時，胃癌荷瘤小鼠模型構建成功。胃癌荷瘤模型建立成功的小鼠腹腔注射100 mg·kg-1CTX，每天1次，連續3 d，建立小鼠化療后骨髓抑制模型[13]。造模完成第2天開始給藥，吉粒芬組小鼠皮下注射12 μg·kg-1吉粒芬，益髓方組小鼠灌胃40.4 g·kg-1益髓方水煎液，吉粒芬+益髓方組小鼠灌胃40.4 g·kg-1益髓方水煎液同時皮下注射12 μg·kg-1吉粒芬，正常組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續7 d。

2.3 全自動血細胞分析儀檢測小鼠血常規相關指標末次給藥2 h后，小鼠摘眼球取血，與枸櫞酸鈉溶液混合均勻(血液與枸櫞酸鈉溶液的比例為91)，采用全自動血細胞分析儀檢測白細胞(white blood cell，WBC)計數、紅細胞(red blood cell，RBC)計數、血紅蛋白(hemoglobin，Hb)總量和血小板(platelet，PLT)計數等血常規相關指標。

2.4 流式細胞儀檢測小鼠外周血免疫細胞亞群比例收集各組小鼠血液1 mL，按照2.3所述方法抗凝后，1 000 r·min-1離心10 min，取血漿100 μL，加入1 mL 10%溶血素，混合均勻后反應10 min，PBS洗滌2次，加入熒光標記的CD3、CD4和CD8流式抗體，4 ℃避光孵育20 min，流式細胞儀檢測CD3+、CD4+和CD8+淋巴細胞亞群比例。

2.5 ELISA法檢測小鼠血清造血細胞因子的表達將各組小鼠血液在4 ℃冰箱中靜置2 h，3 000 r·min-1離心10 min，取血清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，繪制標準曲線，計算各組小鼠血清中IL-3、IL-6、TPO、EPO和GM-CSF的水平。

2.6 瑞氏-吉姆薩染色檢測小鼠骨髓有核細胞(bone marrow nucleated cells，BMNCs)小鼠處死后，無菌條件下分離兩側股骨，剪去股骨兩端，6號針頭吸取生理鹽水沖洗骨髓腔，將沖出的骨髓細胞制成單個骨髓細胞懸液，吸取5 μL制備細胞涂片，自然干燥后滴加瑞氏-吉姆薩復合染液2～3滴，染色1～2 min，滴加PBS緩沖液，輕輕晃動涂片，使之與瑞氏-吉姆薩染液混合均勻后再染色 3～5 min，水洗，置于顯微鏡高倍鏡下對細胞進行分類計數。

2.7 流式細胞儀檢測小鼠骨髓細胞周期變化將2.6項下所述方法制備的骨髓細胞懸液轉移到離心管，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，加1 mL PBS重懸，加入2 mL無水乙醇混勻，4 ℃ 固定30 min，1 000 r·min-1離心5 min，PBS洗滌2次，加入100 μL PBS重懸，再加入500 μL含有50 mg·L-1PI的PBS，混勻，4 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測骨髓細胞周期變化。

2.8 Western Blot檢測小鼠骨髓細胞中Notch信號通路相關蛋白表達水平按2.6項下所述方法收集小鼠骨髓細胞，提取蛋白并進行定量，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳，濕轉至PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h，加Jag1、Notch2、Numb1、Numb2一抗(11 000)，4 ℃孵育過夜，加二抗(11 000)，37 ℃孵2 h后，加發光試劑，于凝膠成像儀中成像，Image J軟件對各個目的蛋白和內參蛋白GAPDH的灰度值進行量化，計算目的蛋白的相對表達量。

3 結果

3.1 益髓方對小鼠血常規相關指標的影響與正常組比較，模型組小鼠WBC、RBC、PLT計數及Hb總量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，益髓方組小鼠WBC、PLT計數顯著升高(P<0.05)，吉粒芬組和吉粒芬+益髓方組小鼠WBC、RBC、PLT計數及Hb總量顯著升高(P<0.05)；與吉粒芬組比較，益髓方組小鼠WBC、RBC計數及Hb總量顯著降低(P<0.05)，而吉粒芬+益髓方組小鼠WBC、RBC、PLT計數顯著升高(P<0.05)；與益髓方組比較，吉粒芬+益髓方組小鼠WBC、RBC、PLT計數及Hb總量顯著升高(P<0.05)。提示，益髓方可顯著改善化療后骨髓抑制模型小鼠的血常規異常，且吉粒芬與益髓方聯合用藥效果更佳。見圖1。

注：A：WBC計數；B：RBC計數；C：Hb含量；D：PLT計數；與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與吉粒芬組比較，cP<0.05；與益髓方組比較，dP<0.05圖1 益髓方對小鼠血常規相關指標的影響

3.2 益髓方對小鼠外周血免疫細胞亞群比例的影響與正常組比較，模型組小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+細胞比例和CD4+/CD8+比值均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+細胞比例和CD4+/CD8+比值均顯著升高(P<0.05)；與吉粒芬組比較，益髓方組小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+細胞比例顯著降低(P<0.05)，而吉粒芬+益髓方組小鼠外周血CD3+、CD4+細胞比例和CD4+/CD8+比值均顯著升高(P<0.05)；與益髓方組比較，吉粒芬+益髓方組小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+細胞比例和CD4+/CD8+比值均顯著升高(P<0.05)。提示，益髓方可顯著改善化療后骨髓抑制模型小鼠的免疫抑制，且吉粒芬與益髓方聯合用藥效果更佳。見圖2。

注：A：CD3+細胞比例；B：CD4+細胞比例；C：CD8+細胞比例；D：CD4+/CD8+比值；與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與吉粒芬組比較，cP<0.05；與益髓方組比較，dP<0.05圖2 益髓方對小鼠外周血免疫細胞亞群比例的影響

3.3 益髓方對小鼠血清造血因子水平的影響與正常組比較，模型組小鼠血清IL-3、IL-6、TPO、EPO、GM-CSF的水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，吉粒芬組小鼠血清IL-3、IL-6的水平顯著升高(P<0.05)，益髓方組和吉粒芬+益髓方組小鼠血清IL-3、IL-6、TPO、EPO、GM-CSF的水平顯著升高(P<0.05)；與吉粒芬組比較，益髓方組和吉粒芬+益髓方組小鼠血清IL-3、IL-6、TPO、EPO、GM-CSF的水平顯著升高(P<0.05)；與益髓方組比較，吉粒芬+益髓方組小鼠血清IL-3、IL-6、TPO、EPO、GM-CSF的水平顯著升高(P<0.05)。提示，益髓方可顯著改善化療后骨髓抑制模型小鼠的骨髓造血功能，且吉粒芬與益髓方聯合用藥效果更佳。見圖3。

3.4 益髓方對小鼠BMNCs數量的影響與正常組比較，模型組小鼠BMNCs計數明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，益髓方組和吉粒芬+益髓方組小鼠BMNCs計數均明顯升高(P<0.05)；與吉粒芬組比較，益髓方組和吉粒芬+益髓方組小鼠BMNCs計數均明顯升高(P<0.05)。見圖4，圖5。

注：A：IL-3；B：IL-6；C：TPO；D：EPO；E：GM-CSF；與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與吉粒芬組比較，cP<0.05；與益髓方組比較，dP<0.05圖3 益髓方對小鼠血清造血因子水平的影響

圖4 瑞氏-吉姆薩染色觀察各組BMNCs計數(×1 000)

3.5 益髓方對小鼠骨髓細胞周期的影響與正常組比較，模型組小鼠骨髓細胞處于G0/G1期的細胞比例顯著升高(P<0.05)，S期細胞比例顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，吉粒芬組小鼠骨髓細胞處于G0/G1期細胞比例顯著降低(P<0.05)，G2/M期細胞比例顯著升高(P<0.05)；益髓方組和吉粒芬+益髓方組小鼠骨髓細胞處于G0/G1期細胞比例顯著降低(P<0.05)，S期和G2/M期細胞比例顯著升高(P<0.05)；與吉粒芬組比較，益髓方組和吉粒芬+益髓方組小鼠骨髓細胞處于G0/G1期細胞比例顯著降低，S期和G2/M期細胞比例顯著增加(P<0.05)。見圖6，表1。

表1 各組小鼠骨髓細胞周期情況比較

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與吉粒芬組比較，cP<0.05圖5 各組小鼠BMNCs數量比較

圖6 各組小鼠骨髓細胞周期分布圖

3.6 益髓方對小鼠骨髓細胞Notch信號通路相關蛋白表達水平的影響與正常組比較，模型組小鼠骨髓細胞中Numb1、Numb2的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Jag1、Notch2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組小鼠骨髓細胞中Numb1、Numb2的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Jag1、Notch2的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與吉粒芬組比較，益髓方組和吉粒芬+益髓方組小鼠骨髓細胞中Numb1、Numb2的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Jag1、Notch2的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與益髓方組比較，吉粒芬+益髓方組小鼠骨髓細胞中Numb1、Numb2的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Jag1、Notch2的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖7，圖8。

圖7 Western Blot檢測各組小鼠骨髓細胞中Notch信號通路相關蛋白的表達

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與吉粒芬組比較，cP<0.05；與益髓方比較，dP<0.05圖8 各組小鼠骨髓細胞Notch信號通路蛋白表達水平比較

4 討論

骨髓抑制是癌癥患者化療過程中極易出現的不良反應，導致患者無法足量、按時完成化療，因此，在臨床治療中，骨髓抑制的發生被認為是癌癥化療成功與否的關鍵[14]。骨髓抑制的臨床表現主要為外周血WBC、RBC、PLT等明顯減少，患者有出血、貧血和免疫力下降等臨床癥狀。中醫學認為，化療后骨髓抑制與氣血不足、脾腎兩虛有關，可通過健脾補血、補腎益髓的方法提高骨髓造血功能、增強免疫力[15-16]。益髓方由龜甲、黃芪、黨參、白術、黃精、菟絲子、雞血藤、枸杞子、紫珠草、仙鶴草、花生衣、大棗共十二味中藥材組成，方中龜甲潛陽填髓，黨參、黃芪和白術健脾養胃、補中益氣，黃精和菟絲子補脾益氣、滋補腎精，雞血藤和枸杞子補血通絡、補腎養血，紫珠草、仙鶴草和花生衣凝血止血，大棗健脾益氣，諸藥聯合使用共奏健脾補血、補腎益髓之功效，能夠顯著改善生血環境，提高患者造血功能，改善貧血癥狀。本研究構建胃癌小鼠化療后骨髓抑制模型，全自動血細胞分析儀檢測小鼠血常規指標發現，胃癌荷瘤小鼠使用CTX進行化療后，外周血WBC、RBC、Hb、PLT水平均顯著降低，給予益髓方治療后WBC、PLT顯著升高，而益髓方和吉粒芬聯合使用可顯著提高小鼠外周血WBC、RBC、PLT計數和Hb水平，表明益髓方能夠顯著改善化療后骨髓抑制小鼠外周血象，聯合吉粒芬使用效果優于益髓方單用。

惡性腫瘤的發生與免疫系統功能的改變密切相關，T淋巴細胞主要介導細胞免疫，大多數惡性腫瘤患者在化療后出現外周血CD3+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞減少，CD8+T淋巴細胞水平增加的現象[17-18]。CD3+T細胞代表總T細胞水平，主要反映機體的細胞免疫狀態，根據細胞表面標志物不同，T淋巴細胞分為CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞兩個主要亞群，CD4+T淋巴細胞具有提高免疫的作用，CD8+T淋巴細胞則相反，CD4+和CD8+T淋巴細胞在正常機體處于動態平衡，當這一平衡被打破，機體的免疫功能則出現紊亂[19-20]。本研究結果顯示，模型組小鼠外周血CD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞比例和CD4+/CD8+比值均降低，給予益髓方干預后，可使CD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞比例和CD4+/CD8+比值整體升高，且益髓方聯合吉粒芬作用效果更為顯著，提示益髓方聯合吉粒芬可協同改善胃癌小鼠化療后的免疫抑制。

骨髓造血是一個復雜的過程，依賴于造血微環境中多種造血調節因子共同調控。研究表明，IL-3、IL-6、GM-CSF與造血干細胞增殖和分化活動密切相關，能與靶細胞表面受體結合，協同調控造血干細胞的分化和成熟[21-22]。TPO和EPO則是參與血小板和紅細胞生成的關鍵調控因子，可刺激骨髓造血，改善化療后骨髓抑制[23-24]。本研究結果顯示，胃癌荷瘤小鼠化療后血清IL-3、IL-6、TPO、EPO、GM-CSF的水平顯著降低；給予益髓方干預后，小鼠血清IL-3、IL-6、TPO、EPO、GM-CSF水平明顯升高，且益髓方和吉粒芬兩藥聯用的效果顯著優于益髓方單用，表明益髓方與吉粒芬聯合可協同升高血清造血因子水平。另外，與正常組比較，模型組小鼠BMNCs計數明顯降低，G0/G1期細胞比例增加，S期細胞比例減少；給予益髓方后BMNCs數量升高，G0/G1期細胞比例降低，S期和G2/M期細胞比例顯著升高，表明益髓方可改善骨髓造血微環境，促進骨髓造血細胞的增殖。

Notch信號通路是一條進化高度保守的信號轉導途徑，與多種癌癥的發生發展密切相關。研究表明，Notch1和Jag1是胃癌中獨立的預后不良指標[25-26]。Numb是Notch信號通路的負調節基因，可抑制Notch信號通路的激活，在機體發育和微環境穩態中起重要作用[27]。研究顯示，下調荷瘤小鼠骨髓細胞中Jag1、Notch2的表達可改善造血微環境，減輕小鼠化療后骨髓抑制，提高骨髓細胞造血功能[28]。白鴿等[29]研究發現，骨髓抑制小鼠骨髓細胞中Numb2mRNA表達量顯著降低，Jag1mRNA的表達增加。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠骨髓細胞Numb1、Numb2的蛋白表達水平顯著降低，Jag1、Notch2蛋白表達水平顯著升高；給予益髓方干預后，Numb1、Numb2蛋白表達顯著升高，Jag1、Notch2蛋白表達顯著降低，且吉粒芬與益髓方聯合用藥組的作用效果優于益髓方單用，表明益髓方可單獨或協同吉粒芬上調Numb1和Numb2的表達水平，抑制Notch信號通路的過度活化。

綜上所述，益髓方可單獨或協同吉粒芬改善胃癌化療后骨髓抑制小鼠外周血象，提高外周血免疫細胞亞群水平及血清造血因子IL-3、IL-6、TPO、EPO、GM-CSF水平和骨髓BMNCs數量，改善骨髓造血微環境，促進骨髓造血細胞的增殖，其作用可能與抑制Notch信號通路的過度活化有關。