油茶殼堆肥微生物的培養及功能芽孢桿菌的篩選和初步應用

張聲峰 陳碩昌 梁文鳳 嚴祥 馮藝峰 李桂珍 楊輝

摘要：【目的】從自然狀態下的油茶殼堆肥產品中篩選功能芽孢桿菌，為油茶殼堆肥高效生產、飼料發酵等應用提供菌劑。【方法】利用高通量測序技術測定廣西某油茶殼堆肥中微生物群落分布，篩選適宜堆肥微生物生長的培養基以獲得多樣性較豐富的堆肥芽孢桿菌菌群，經平板稀釋涂布法分離純化菌株，使用水解圈法和酶活測定方法進行水解酶功能分析，利用菌株形態特征觀察、16S rDNA分子鑒定法明確菌株的種屬，并運用分子生物學軟件MEGAX構建系統發育樹。使用重鉻酸鉀法測定腐殖酸含量。【結果】芽孢桿菌科（Bacillaceae）是優勢菌科，占比達55.58%;分離到15株芽孢桿菌，同時具有淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶3種水解酶活性的菌株有6株;同時具有淀粉酶和纖維素酶活性的有1株;儀具有蛋白酶或纖維素酶一種酶活性的有2株。其中菌株Bacillus sp.YXI1的蛋白酶活力達到27 07±3.28 U-mL-1，淀粉酶活力達123 97±3.19 U-mL-1，纖維素酶活力達15 75±0.23 U-mL-1。含有這15株菌的復合菌制劑有利于腐殖酸的生成，提高了堆肥品質。【結論】鑒定出的Bacillus cereus YX02和Bacillusflexus FYF01等菌株具有進一步研究丌發的價值，可用于開發油茶殼堆肥微生物菌制劑。

關鍵詞：油茶殼堆肥;芽孢桿菌;功能性;篩選;應用

中圖分類號：X 712;X53

文獻標志碼：A

文章編號：1008-03 84（ 2021） 07-0843-12

Functional Bacillus Species in Camellia Seed Shell Compost

ZHANGShengfeng 1， CHENShuochang 1， LIANGWenfeng 1， YANXiang 1. FENGYifeng 1， LIGuizhen 2. YANGHui 1*

（ I. College ofLife Science and Technology， Guangxi UniTJersity. Nanning， Guangxi 530004. China;

2. Guangxi Academy ofForestry Sciences， Nanning， Guangxi 530000， China ）

Abstract：【Objective】Bacillus spp that contribute to the fermentation of Camellia oleifera seed shells were isolated foreffective composting of the waste material. 【Method】 The microbial community in natural camellia seed shell compostfound in Guangxi was studied using the high-throughput sequencing technology. Suitable culture medium to foster the growthof richly diverse Bacillus spp from the compost was selected. Flora isolation by dilution with a streaking plate methodfollowed. The hydrolase activities of the isolates were determined by using the hydrolysis circle method and enzyme activityanalysis， the species identified by a 16S rDNA analysis， and the phylogeny constructed by MEGAX. The content of humic acidin the compost was measured by a potassium dichromate method. 【Result】 Bacillaceae was the dominant family in thecompost. It accounted for 55.58% of all isolated flora. Among the 15 Bacillus isolates. 6 exhibited activities of amylase，cellulase， and protease， one of amylase and cellulase. and 2 0f protease or protease. Strain YXI I showed a protease activity of27.07+3.28 U·mL-1. an amylase activity of 123.971- 3.19 U·mL-1. and a cellulase activity of 15.75+0.23 U·mL-1 In thepresence of numerous Bacillus spp that secreted varieties of hydrolases， formation of humic acid in the compost was enhanced.【Conclusion】 Some of the isolated strains. such as B. cereus YX02 and B. flexus FYFOI， might warrant further investigationto develop microbial inoculants for efficient composting camellia seed shells.

Key words： camellia seed shell compost; bacillus; functional; screening; application

0 引言

【研究意義】油茶是我國特有的木本食用油料樹種。油茶殼是油茶果實加工茶油的副產品，隨著油茶產業的發展，每年都有大量油茶殼產生。油茶殼占整個油茶果實質量的60%以上，其主要成分是纖維素、半纖維素、木質素[1]，已經在有機肥料、鉀鹽、活性炭的生產中得到利用，具有廣闊的發展空間與市場空間‘糾。以油茶殼為主要原料的堆肥，可以把儲量豐富、價格低廉的油茶殼資源充分利用。油茶殼堆肥產品的生產和使用，不僅減少對大氣、土壤、水質的污染，也減少化肥投入，增加農產品產量，提高了農民收入。【前人研究進展】微生物在堆肥生產中有重要的作用，添加微生物加速農業副產品堆肥的研究開發已經比較普遍。如Shrestha等[3]進行微生物強化牛瘤胃內容物堆肥的研究。Song等[4]開發一種協同降解有機酸的微生物聯合體（ MCDOA），加速蛋白質類化合物的降解和復雜的類腐殖質物質的形成，并改善醋酸、丙酸降解菌和木質素降解菌的原生菌群結構和多樣性，有效縮短餐廚垃圾堆肥周期。Yu等[5]將嗜熱芽孢桿菌接種于污泥堆肥中，提高了堆肥的質量和效率。由于芽孢桿菌在農業副產品堆肥生產中有重要作用，其現已成為應用最多的微生物菌制劑[6.7]，如：可以從堆肥中分離出降解纖維素的嗜熱芽孢桿菌[8];將松樹皮制成堆肥，接種芽孢桿菌屬等有益的微生物，可以增強對樹木根病菌的抑制作用，減少在苗圃使用殺菌劑[9];以蘿卜細菌性葉斑病為例，探討堆肥對植物葉面病害的抑制作用，并對堆肥中可能起抑制作用的根際細菌進行了鑒定，發現抑制病害最顯著的是芽孢桿菌屬[1O];利用芽孢桿菌研制固體菌制劑可促進園林廢棄物堆肥過程中木質素、纖維素的降解和腐殖質的合成[ll];從完全腐熟的餐廚垃圾有機肥中篩選出芽孢桿菌復合菌劑，能夠明顯縮短堆肥周期和提高餐廚垃圾降解率[12]。這些研究表明芽孢桿菌具有降解纖維素、抑制致病菌、提高餐廚垃圾降解率和縮短堆肥周期等功能。【本研究切入點】目前，油茶殼堆肥存在生產效率低和品質不高等問題，對油茶殼堆肥的研究報道[13-15]還比較少，且對油茶殼堆肥中功能性芽孢桿菌的研究有待進一步深入。【擬解決的關鍵問題】利用高通量測序技術[16]探究廣西某農場自然狀態下的油茶殼堆肥產品中的微生物多樣性組成，再通過選擇合適的培養基，獲得實驗室環境下物種多樣性相對比較豐富的堆肥芽孢桿菌菌群。從中篩選具有水解酶功能特性和其他功能特點的芽孢桿菌，并應用16S rDNA鑒定其系統發育關系和分類學地位，最終完成應用效果試驗。為今后開發油茶殼堆肥微生物菌制劑、提升油茶殼堆肥的生產效率和品質，以及飼料發酵等應用方面提供了菌種資源。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1樣品來源 堆肥樣品來自廣西某農場自然狀態下的油茶殼堆肥，呈褐色固體顆粒或團狀，pH7.96，含水率37.35%。

1.1.2試劑 EazyTaq酶，北京聚合美生物科技有限公司生產，XDNA/HindⅢDNA Marker、DL2000 DNAMarker、dNTPMix，TaKaRa試劑（大連）公司生產;柱式PCR產物純化試劑盒，上海生工生物技術有限公司生產;革蘭氏染色液，購白廣東環凱微生物科技有限公司;酵母粉和蛋白胨，均購白Oxoid（英國）公司;MiSeq Reagent Kit v3測序試劑盒，購白美國Illumina公司;biowest agArose瓊脂糖，購白西班牙biowest公司;其他試劑均為國產分析純。

1.1.3培養基 采用的4種常規培養基：（1） LB培養基[17]。（2）淀粉培養基：蛋白胨10 9.L 1，NaC15g·L-l，牛肉膏5 g·L-l，可溶性淀粉10 g·L-l，瓊脂15 g·L-l，pH 7.0～7.2。（3）脫脂乳培養基：用于蛋白酶活性的鑒定試驗，分別配制A液和B液。A液：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 h，NaC1 0.5 g，瓊脂2 g，pH7.0～7.2，共50 mL;B液：脫脂奶粉3 g，pH 7.0～7.2，50 mL。A、B單獨滅菌，使用時混合。（4）剛果紅纖維素培養基：K2HP04 0.5 g·L-l，MgS04 0.25g·L-l，剛果紅0.2 g·L_1，CMC-Na 2 g·L-l，NaC11.0g·L-l，瓊脂20 g·L-l，pH 7.0-- 7.2。通過參考適宜芽孢桿菌生長的培養基[18-20]，設定堆肥微生物生長的6組篩選培養基：M1：紅糖6 g·L-l，酵母粉1 g·L-l，豆粕1 g·L_1，硫酸銨4 9.L_1，MgS04 1 9.L 1，MriS040.03 g·L_1，蛋白胨4 g·L-1，pH 7.0～7.2; M2：葡萄糖6 g·L-l，酵母粉1 g·L-l，豆粕1 g·L-l，硫酸銨4 g·L-l，MgS04 1 g·L-l，MnS04 0.03 g·L-l，蛋白胨4 g·L_1，pH 7.0-- 7.2; M3：紅糖5 g·L-l，酵母粉3 g.L-l，NaC1 2 g·L-l，乙酸鈉5 g·L-l，L一半胱氨酸鹽0.5 g·L-l，可溶性淀粉1 g·L-l，蛋白胨5 g·L-l，pH7.0—7.2;M4：葡萄糖20 9.L-1，酵母粉4 g·L_1，乙酸鈉5 g·L_1，硫酸銨2 g·L-1，MgS04 0.5 g·L-1，MnS04 0.2 g·L-1，蛋白胨12 g·L-1，檸檬酸氫二胺2 g·L-1，吐溫一80 1 g·L-1，CaC03 2 g·L-1，K2HP040.5 g·L-1，pH 7.0～7.2;M5：紅糖5 g·L-1，FeS040.2 g·L-1，KC1 0.5 g·L-1，硫酸銨3 g·L-1，MgS040.5 g·L-1，MnS04 0.06 g·L-1，K2HP04 4 g·L-1，pH7.0～7.2;M6：紅糖10 g·L-1，酵母粉2 g·L-1，豆粕2 g·L-1，尿素10 g.L-1，pH 7.0～7.2。

1.2試驗設計

1.2.1油茶殼堆肥微生物多樣性分析 采集適量油茶殼堆肥樣品，送至Shanghai Majorbio Bio—pharmTec11110109y Co.Ltd完成16S rDNA高通量測序，細菌的通用引物序列為：806R（5'一GGACTACHVGGGTWTCTAAT一3 '）與338F（5 '一ACTCCT—ACGGGAGGCAGCAG一3 '）;測序區域V3～V4區，測序平臺為IIIumina MiSeq。使用UPARSE軟件（version 7.1，http：//drive5.com/uparse/），以97%的相似度對序列進行0TU聚類，以UCHIME軟件剔除嵌合體。通過RDP classifier對測定的序列完成物種分類注釋，然后比對Silva數據庫（SSU128），設置70%的比對閾值最終確定堆肥中微生物的種群結構。

1.2.2堆肥微生物培養基的篩選 比較Ml—M6共6組培養基對堆肥微生物生長的影響，每組培養基設3個試驗組，代表3種培養條件：膠塞封口厭氧靜置培養，按M1～M6編號為1一Y，2一Y，3一Y，4一Y，5一Y，6一Y;紗布封口好氧靜置培養，按M1～M6編號為1一HJ，2一HJ，3一HJ，4一HJ，5一HJ，6一HJ;紗布封口好氧搖床培養（100 r.min-1），按M1～M6編號為1一HY，2一HY，3一HY，4一HY，5一HY，6一HY。初始pH均為7.0～7.2。將新鮮堆肥樣品的無菌生理鹽水洗滌液以1%的量接種于各培養基中，培養溫度37℃。于培養后的第1、2、3、5、7、15、22、30 d，使用紫外分光光度計測定0D600值。培養后的第3、7、15、30 d，使用平板計數法統計原核微生物菌數，并使用光學顯微鏡觀察培養液的微生物形態。

1.2.3芽孢桿菌平板初篩 堆肥樣品經最佳培養基培養后，使用十倍稀釋法[21]涂布平板，分離單菌落。

1.2.4菌株的形態學鑒定 在平板上觀察菌株的菌落形態、菌落顏色和質地等，并挑取菌落進行革蘭氏染色[22]。

1.2.5菌株的16S rDNA鑒定 分別提取菌株基因組DNA[23]，通過PCR擴增其16S rDNA'2]，送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序。結果進行核酸BLAST[25]分析比對，利用MEGAX構建系統發育樹[26]。

1.2.6菌株的水解酶功能的初篩和測定

（1）水解酶活性的平板初篩

蛋白酶活性的初篩：將經純化菌株點種在脫脂乳培養基上，觀察培養基的周圍是否產生透明的水解圈[27]。淀粉酶活性的初篩：使用Elamary等[28]的方法對菌株淀粉酶水解活性進行了篩選，水解圈的出現作為菌株產淀粉酶的依據。纖維素酶活性的初篩：使用剛果紅纖維素培養基法，進行纖維素酶活性鑒定[29]。

（2）菌株的基礎發酵

將菌株接種到LB液體發酵培養基，于37℃培養24h后測定水解酶活性。

（3）水解酶活力的測定

粗酶液的制備：將初篩菌株的發酵液于4℃、8000 r·mm-1條件下離心10 min，除菌體后上清液即為粗酶液。蛋白酶活力檢測采用福林酚法[30]，蛋白酶活力單位定義為：在37℃、pH 7.8的條件下，每分鐘催化酪蛋白水解生成1 ug酪氨酸的酶量。淀粉酶活力檢測采用曹丹等[31]使用的方法，淀粉酶活力單位定義為在37℃、pH 6.0的條件下，每分鐘催化可溶性淀粉水解生成1 ug還原糖的酶量。纖維素酶活力檢測采用DNS法[32]，酶活定義為在37℃、pH5.5的條件下每分鐘催化羧甲基纖維素鈉產生1 ug葡萄糖的酶量。

1.2.7菌株在油荼殼堆肥中的應用試驗 將篩到的15株菌使用LB發酵培養基單獨培養24 h，然后各取l mL混合，制成微生物菌制劑。設置一個添加菌制劑的試驗組，不添加菌制劑的對照組，每個組3個平行。使用250 mL三角瓶，各試劑按表1的配方添加，初始pH 7.2，紗布封口，于37℃下，搖床轉速120 r.mm_1培養。使用重鉻酸鉀法[33]測定培養15 d的腐殖酸含量。

2結果與分析

2.1微生物群落分析結果

利用高通量測序技術對油茶殼堆肥中微生物的多樣性進行測定，結果顯示（圖1），芽孢桿菌科（Bacillaceae）是堆肥中的優勢菌科，其占比達到55.58%，表明芽孢桿菌在油茶殼堆肥微生物中占主導地位。

2.2堆肥微生物在不同培養基中的培養效果

采用M1—M6六組培養基在不同條件下培養堆肥微生物，培養液的OD600和菌數變化結果如圖2所示，結合鏡檢菌株形態多樣性分析，表明M2培養基最佳：在厭氧培養下菌數可達到（ 1.91±0.10）×108CFU·mL-1;好氧靜置培養下，菌數最高可達到（ 33.3±0.59）×lOs CFU.mL-l;好氧搖床培養下，菌數最高可達到（ 1.19±0.13）×lO 8 CFU·mL-l。且鏡檢結果表明，M2培養基培養的微生物多樣性更豐富。

2.3菌株形態學鑒定結果

經平板劃線純化，分離到15株菌。它們在LB培養基上的菌落形態、菌落顏色和質地等如表2所示。經過染色后在光學顯微鏡下放大4 000倍觀察到的菌體形態，如圖3所示。

2.4菌株的分子生物學鑒定結果

2.4.1 PCR擴增驗證結果 將篩到的15株菌提取基因組DNA，通過PCR擴增其16S rDNA序列，使用瓊脂糖凝膠電泳驗證，如圖4所示，結果顯示擴增片段大小約為1.5 kb，與16S rDNA預期大小相符，可以用于測序分析。

2 .4.2菌株的16S rDNA序列分析 將分離到的菌株的16S rDNA測序結果在NCBI上比對后與相似性高的菌株共同構建系統發育樹。根據相似性和系統發育樹進化距離，鑒定YX02為蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus[34]）.YX15為海洋短桿菌（Brevibacteriumoceani[35]）.FYFOI為彎曲芽孢桿菌（Bacillusflexus[36]）。其他菌株由于在單獨比對時有多個芽孢桿菌屬內不同種的芽孢菌株與其相似性都很高且進化距離非常接近，單純依賴16S rDNA序列比對尚不能準確鑒定到種，只能初步鑒定到芽孢桿菌屬。從油茶殼堆肥中分離出的15菌株16S rDNA序列比對結果見表3。

構建的系統發育樹如圖5所示，從發育樹可以看到，有12株菌暫時鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）的不同菌株。比如菌株YX03、YX16、YX11和YX13，以及菌株FYF07、FYF04和FYFlO，在進化距離上非常接近，但根據菌落形態特征不同以及水解酶活性的差異，可推斷是同一屬內的不同菌株。在今后的研究中，將通過生理生化、DNA分子雜交技術鑒定等方式，進一步確定這些菌株的菌種類別。

2.5酶學水解酶活性的初步鑒定結果

2.5.1蛋白酶活性分析 將各菌株點種在脫脂乳培養基上，平板初篩蛋白酶的結果見表4所示。有7株菌產生蛋白酶水解圈，其中，透明圈和菌落直徑比值（ D/d）最大的是菌株FYF04，其次是菌株FYF07。D/d值一定程度上說明了菌株產蛋白酶能力的大小，但還需要測定發酵液中酶的活性，以進一步驗證菌株的產酶能力。

2.5.2淀粉酶活性分析 將各菌株點種在淀粉培養基上，平板初篩淀粉酶的結果如表4所示，共有7株菌產生淀粉酶水解圈，其中，透明圈和菌落直徑比值（ D/d）最大的是菌株YXI1，其次是菌株FYF01。D/d值一定程度上說明了菌株產淀粉酶能力的大小，但還需要測定發酵液中酶的活性，以進一步驗證菌株的產淀粉酶的能力。

2.5.3纖維素酶活性分析 將各菌株點種在剛果紅培養基上，平板初篩纖維素酶的結果如表4所示，共有8株菌產生纖維素酶水解圈，其中，透明圈和菌落直徑比值（ D/d）最大的是菌株FYFOI，其次是菌株FYF04。D/d值一定程度上說明了菌株產纖維素酶能力的大小，但還需要測定發酵液中酶的活性，以進一步驗證菌株的產纖維素酶的能力。

2.5.4三種水解酶活力的測定 將各菌株進行液體發酵，測定粗酶液的水解酶的活力。最終初步測定初篩菌株的各酶活力的結果如圖6所示。其中，蛋白酶活力最高菌株是Bacillus sp.YX11，27 07±3.28U·mL-l; Bacillus sp.FYFlO次之， 為13.67±3.18U·mL-1。淀粉酶活力最高菌株是Bacillus sp.YX13，達144.10±2.65 U-mL-l; Bacillus sp.YXlI次之，為123.97±3.19 U·mL-l。纖維素酶活力最高菌株是Bacillus sp.YXI1，達15.75±0.23 U·mL-l; Bacillus sp.YX03次之，為13.83±0.10 U·mL-l。

這些芽孢桿菌有9株菌初步顯示具有一定的水解酶功能特性，其中同時具有淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶三種水解酶活性的菌株有6株，同時具有淀粉酶和纖維素酶活性的有1株，僅具有蛋白酶或纖維素酶一種酶活性的有2株。表明這些菌株在油茶殼堆肥中具有促進纖維素向小分子葡萄糖轉化、促進蛋白質向小分子肽和氨基酸轉化以及促進淀粉向小分子麥芽糖和葡萄糖轉化的功能性作用。

2.6菌株在油茶殼堆肥中的初步應用

腐殖酸是堆肥過程中生成的最具代表性的次生產物，對于肥料的發酵腐熟程度具有一定的表征性，是衡量堆肥品質的重要指標。培養15 d后，測定添加15株菌菌制劑的試驗組腐殖酸平均含量是7.08%，是對照組腐殖酸平均含量（5.68%）的1.25倍，如圖7所示。試驗組高于對照組，添加15株菌的菌制劑有利于油茶殼堆肥腐殖酸的生成，提高了堆肥品質。

3討論

目前，研究農業副產品堆肥中微生物的影響和作用機理的研究報道已經比較普遍。其中有關微生物水解酶的研究已經成為研究的熱點之一，且已有很多研究證實，芽孢桿菌分泌的水解酶對纖維素或蛋白質的降解尤為關鍵。如Liu等[37]研究了城市固體廢物堆肥中不同堆肥階段產纖維素酶的關鍵微生物種群，發現纖維素的有效分解依賴于細菌和真菌的協同作用。聶文翰等[38]將含有芽孢桿菌的復合菌劑添加到秸稈堆肥中，施加這種秸稈堆肥后，土壤纖維素酶活性提高了30.8%，普通白菜產量比對照組提高46.4%。從高溫堆肥中分離到1株芽孢桿菌（Geobacillus stearotherrriophilus），在最適條件下能分泌大量的降解木質纖維素的酶，被認為是一種潛在的提高堆肥效率的菌種[39]。在農業副產品豆粕微生物發酵中添加蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）和糞腸球菌，抗原蛋白降解率達到90%以上[40]。本研究探索了自然狀態下油茶殼堆肥中的芽孢桿菌，9株芽孢桿菌初步顯示具有一定的水解酶功能特性，其中同時具有淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶3種水解酶活性的菌株有6株。因此，在后續研究中，利用微生物發酵工藝條件優化以及酶活測定方法，集中對產酶活性較強的菌株的研究，以期獲得高產纖維素酶或蛋白酶的微生物，有助于提升油茶殼堆肥的生產效率和提高堆肥品質，并將在飼用酶制劑中具有較大的應用潛力。

此外，利用微生物來消除農業生產中的農藥污染是一種非常安全、經濟、有效的方法[41]。本研究從油茶殼堆肥中篩選到蠟狀芽孢桿菌，即菌株Bacilluscereus YX02。關于蠟狀芽孢桿菌的報道已有很多，如研究了對重金屬鉛、鋅、鉻有強吸附能力的一株蠟狀芽孢桿菌[42]，完成了蠟狀芽孢桿菌吸附鉛的研究[43]，分離鑒定了強抗鎘蠟狀芽孢桿菌[44]，發現蠟狀芽孢桿菌對毒死蜱有很高的降解率[45]。也有研究證實，利用植物高羊茅與羊茅共植，結合蠟狀芽孢桿菌，可顯著修復被重金屬與十溴二苯醚BDE-209共污染的土壤[46];從礦山尾礦中分離到的蠟狀芽孢桿菌（ TIB3），具有促進植物生長的特性，并可以提高植物修復重金屬污染的效率[47]。這些結論表明了本研究發現的菌株（Bacillus cereus YX02）可能具有處理重金屬、促進植物生長和消除農藥污染的應用價值。另外，本研究中篩選到的菌株FYF01是彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）。已有研究表明某些彎曲芽孢桿菌具有促進植物生長、處理造紙廢水、殺滅害蟲等應用價值。如彎曲芽孢桿菌在鹽脅迫下能促進寄主植物生長，在鹽漬土的植物修復中具有潛在的應用前景[48];一株彎曲芽孢桿菌能夠降解堿木質素，利用該菌能夠處理復雜的造紙廢水，是一種很有前途的微生物修復劑[49];一種彎曲芽孢桿菌對蒽醌類染料有脫色和脫毒作用，可用于染料廢水的生物處理[50];彎曲芽孢桿菌可以成為生物殺蟲劑，用作合成殺蟲劑的環境安全替代品[51]。在今后的研究中，將繼續挖掘菌株上述方面的功能，或將為油茶殼堆肥產品增加改善生態環境的作用提供理論依據和菌種資源。

當今世界常年大量使用化學農藥和肥料，土壤結構被嚴重污染和破壞，這給生態環境帶來災難性后果。因此，各國競相研究和開發微生物資源，希望研制出高效、無毒、無污染的微生物肥料和農藥。開發微生物復合菌制劑，利用群落協同作用以增強微生物的處理能力已經成為一種發展趨勢。比如韓國蔚山的B3（Bio-Best Bacillus）工藝，是先進的污水處理系統。它的主要原理是利用一個以芽孢桿菌占優勢的微生物群落處理污水，能夠有效地去除氮、磷和有機物[52]。本研究中這些功能性芽孢桿菌，在今后的研究中，將繼續探究它們在促進植物生長、處理重金屬、消除污染或殺滅害蟲等方面的功能。以這些功能微生物作為優勢菌種，進行復合培養，提高它們的產酶能力和菌密度，充分利用功能性芽孢桿菌種群的協同作用。在油茶殼堆肥中發現的這些獨特功能的芽孢桿菌，或將對開發出一種既可以消除土壤污染，又能同時殺死農業害蟲的生物肥料有所啟發。

4結論

本研究通過高通量測序技術，確認芽孢桿菌科（Bacillaceae）是油茶殼自然堆肥中的優勢菌科，其占比達到55.58%，對油茶殼堆肥中微生物的群落結構有了進一步了解。通過6組培養基的堆肥微生物培養試驗，篩選出相對最佳的生長培養基，獲得了實驗室環境下物種多樣性相對比較豐富的堆肥芽孢桿菌菌群。最終分離出15株芽孢桿菌，其中有3株菌明確了種屬，分別是Bacillus cereus YX02，Brevibacteriumoceani YX15，和Bacillus flexus FYF01，它們有促進植物生長、消除污染和殺滅農業害蟲的潛在應用價值。這些芽孢桿菌有9株菌初步顯示具有一定的水解酶功能特性，包括Bacillus sp.YXI1等6株菌同時具有3種水解酶的特性。如菌株Bacillus sp. YXIl的蛋白酶活力達到27.07±3.28 U·mL-I，淀粉酶活力達123.97±3.19 U·mL-l，纖維素酶活力達15.75±0.23U·mL-l。這表明這些菌株在油茶殼堆肥和飼用酶制劑等方面有較大的應用潛力。將分離到的15株芽孢桿菌制備復合菌劑，在油茶殼堆肥中獲得較好的初步應用效果，促進腐殖酸的生成，提高了堆肥品質。

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（責任編輯 ：林海清 ）

收稿日期：2021-0302初稿：2021-0425修改稿

作者簡介：張聲峰（ 1990-），男，碩士研究生，研究方向：微生物工程（E-mail： 1908391037@st.gxu.edu.cn）

通信作者：楊輝（ 1972-），男，博士，高級工程師，研究方向：食品發酵和酶工程（E-nlail： huiy422@gxu.edu.cn）

基金項目：廣西科技重大專項（桂科AA20302021-7）;百色市科學研究與技術開發計劃（百科20192129）：廣西特色經濟林培育與利用重點實驗室自主課題（JA-20-04-02）