酸雨脅迫下琯溪蜜柚葉片轉錄組差異表達分析

張瓊 陸鑾眉 朱麗霞

摘要：【目的】研究琯溪蜜柚受酸雨脅迫的內在分子機制，為琯溪蜜柚科學種植提供基礎資料，也為酸雨逆境生理提供理論基礎。【方法】以模擬酸雨脅迫24h的珀溪蜜柚葉片進行Illumina HiSeq TM 4000高通量轉錄組測序分析，將組裝得到的基因在參考基因組、Nr和KEGG數據庫進行比對;利用FDR與log2（ FC）來篩選差異基因，篩選條件為FDR< 0.05且log2（ FC）>1，將篩選的差異基因做GO和KEGG富集分析。【結果】模擬酸雨噴淋24 h后，珀溪蜜柚嫩葉出現明顯塊狀傷斑;共得到21497個基因，全部得到注釋，與對照相比，酸雨處理組中有879個基因顯著上調，588個基因顯著下調;篩選出樣本中前50個DEGs（差異基因），均為上調表達基因，大部分涉及代謝途徑、次生代謝、苯丙基類丙烷生物合成和萜類物質合成等相關基因。GO富集分析表明差異表達基因主要位于細胞外區域;執行分子功能中催化劑活性是最為顯著富集的GO term，其次是氧化還原酶活性;生物過程中差異表達基因最顯著的GO term是DNA代謝過程。KEGG富集分析表明DNA復制是差異表達基因中最顯著富集的Pathway，其次是次生代謝的生物合成，再次是苯丙素類合成途徑。對次生代謝合成途徑中4個差異表達基因[POD同T酶cg39018770和cg29001440、肉桂酰輔酶A還原酶（CCR）同T酶cglg021310.4-香豆酸-輔酶a連接酶（ 4CL）同T酶cg39029290]進行PCR熒光定量分析，驗證了轉錄組數據的可靠性。【結論】珀溪蜜柚對酸雨耐性較強，對酸雨脅迫的響應是多基因參與、多生物過程協同調控的過程.次生代謝的調節可能是應對酸雨脅迫的主要方式。

關鍵詞：琯溪蜜柚;酸雨脅迫;轉錄組測序;差異表達基因

中圖分類號：S 666.3;0 948.1

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2021） 07-075009

Transcriptome Changes of Citrus grandis Seedlings in Response to Acid Rain Stress

ZHANG Qiongl.2，LU Luammeil.2，ZHU Lixia1.2

（1.School of Biological Sciences and Biotechnology， Zhangzhou， Fujian 363000， China;

2.Minnan Normal University， Zhangzhou， Fujian 363000. China）

Abstract：【Objective】Molecular mechanisms of Citrus grandis （L.） Osbeck. cv. Guanximiyou in response to simulated acidrain stress were investigated. 【Method The llumina HiSeq 4000 system，a high-throughput transcriptome sequencingtechnology， was applied to reveal the differential expressions of the grapefruit transcriptome after a 24 h simulated acid raintreatment. The unigenes obtained were compared to the Nr and KEGG database. Abundance of gene expression of the sampleswere screened according to transcriptome data by using PRKM method. Differentially expressed genes （DEGs） among thetreated samples were estimated by referring to the standard of FDR≤0.05 and llog2FC≥1 Functions and pathways of thoseDEGs were analyzed using the Gene Ontology （GO） and KEGG pathway database.【Result】Significant lumpy lesions beganto appear on the young grapefruit leaves 24 h after the artificial acid rain spray with 21 497 fully described unigenes obtainedIn comparison to control， 879 0f the genes were significantly upregulated and 588 downregulated. The top 50 DEGs were all inthe upregulated category and mainly associated with metabolic pathways， secondary metabolism， phenylpropyl propanebiosvnthesis， or terpenoid biosynthesis. The GO enrichment analysis showed the DEGs being largely located in extracellularregion and， among various molecular functions， the catalytic activity being the most significantly enriched， followed byoxidoreductase activity， while the DNA metabolism being the most significant of DEGs in the GO term on biological process.The KEGG enrichment analysis indicated that DNA replication was the most significant enrichment pathway， followed bysecondary metabolic biosynthesis. and lignin synthesis. The PCR fluorescence quantitative analysis on the 4 DEGs in thesecondary metabolic biosynthesis pathway [i.e， POD isozyme cg39018770 and cg29001440， cinnamyl coenzyme A reductase（CCR） isozyme cglg0213 10. and 4-coumaric acid-coenzyme A ligase （4CL） isozyme cg39029290] confirmed that the acid rainstress indeed significantly affected the expressions of these genes.【Conclusion】 C.grandis （L.） Osbeck. cv. Guanximiyouwas strongly tolerant to acid rain. The stress response of the plants involved numerous genes regulated by various collaborativebiological processes. Among them. the regulation of secondary metabolism appeared to play a major role in coping with acidrain stress by the plant.

Key words： Citrus grandis （L.） Osbeck. cv. Guanximiyou; acid rain stress; transcriptome sequencing; differentially expressedgenes

0 引言

【研究意義】瑯溪蜜柚Citrus grandis（L）Osbeck. cv.Guanximiyou是我國優質栽培名柚，為蕓香科柑橘屬果樹，其果大皮薄、汁多柔軟、香甜微酸，原產于福建省漳州市平和縣，已有500多年栽培歷史[1-2]。近些年來平和蜜柚種植面積和產量逐年增加，平和被冠以“世界柚鄉，中國柚都”之稱，是我國最大柚類生產和出口基地。平和縣位于福建省漳州市，屬南亞熱帶氣候，琯溪蜜柚果園土壤為南亞熱帶較為典型的酸性紅壤，由于多年來酸沉降和農業生產活動造成土壤嚴重酸化，是蜜柚產業面臨的主要危機[3-5]。【前人研究進展】酸雨可影響植物葉片結構，破壞植物角質層，使得酸性成分通過氣孔或表皮擴散進入細胞，改變植物莖葉細胞質酸堿平衡，增加細胞膜透性使得葉片中鉀、鈣、鎂等營養元素大量淋失，影響參與基礎代謝、細胞建成、光合和轉錄等過程的蛋白表達水平[6-8]。如酸雨處理顯著上調了擬南芥水楊酸信號轉導途徑和茉莉酸信號通路的基因，也引起擬南芥體內基礎代謝、其他信號轉導途徑相關基因發生變化[9]，使得植株對病原菌具有更強的耐受性[10]。牛力[11]研究發現擬南芥有37個與植物次生代謝相關基因表達量發生變化，木質素、生物堿等次生代謝產物的合成在酸雨處理下加強。張瓊等[12]研究發現雖然琯溪蜜柚葉片具有較強的酸雨抗性，但重度酸雨脅迫（ pH 2.5）顯著抑制葉肉柵欄組織發育和葉片光合速率。【本研究切入點】植物的耐酸機理是個復雜過程，琯溪蜜柚種植區位于酸雨分布區內，雖然前期已經報道了酸雨對琯溪蜜柚理化性質的影響[12]，但酸雨脅迫對琯溪蜜柚影響的分子機制還鮮見報道。因此對酸雨脅迫下琯溪蜜柚葉片轉錄組分析可以從分子生物學層面上闡明琯溪蜜柚耐酸機制，為酸雨區琯溪蜜柚種植提供基礎資料。【擬解決的關鍵問題】本研究以2年生琯溪蜜柚植株為試驗材料，通過Illumina測序平臺，比較轉錄組水平上模擬酸雨處理（ pH 2.5）對幼嫩葉片的影響，分析可能參與抗酸或耐酸調控的相關基因，進一步揭示琯溪蜜柚受酸雨脅迫的響應機理，為琯溪蜜柚科學種植和可持續發展提供理論支持，也為酸雨逆境生理提供基礎資料。

1材料與方法

1.1試驗材料的培育與處理

春天天氣回暖，琯溪蜜柚萌發較快，2018年在2月初修剪2年生琯溪蜜柚，3月初長出部分嫩葉時，選出6棵長勢一致的植株，隨機分為2組，于上午10：00左右對植株進行模擬pH為2.5的酸雨3個重復噴淋（標記為T-1、T-2、T-3），同時清水3個重復噴淋為對照（標記為CK-1、CK-2、CK-3），處理使得嫩葉上下布滿水滴，噴淋24h后采集至液氮，后送至80℃冰箱冷凍保存備用。

1.2 總RNA提取、cDNA合成和轉錄組測序

將冷凍保存的琯溪蜜柚葉片置于干冰盒中，送至廣州基迪奧生物科技有限公司提取總RNA，經過磁珠[帶有Oligo（ dT）]富集純化mRNA。將得到的mRNA隨機打斷為短片段，以這些短片段mRNA為模板，合成cDNA，通過純化、洗脫、修復、回收，最后進行PCR擴增，完成文庫制備。用IlluminaHiSeqTM對文庫進行高通量測序，整個流程由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.3比對參考基因組和轉錄本組裝合并

將過濾完核糖體的reads利用比對軟件TopHat2[13]比對到參考基因組|citrus.hzau.edu.cn Genome ofPummelo（Citrus grandis）|上，再用Cufflinks[14]進行組裝。將多個樣品的組裝結果用Cuffmerge進行合并，過濾錯誤的轉錄本后生成唯一注釋文件。

1.4差異表達基因篩選和功能注釋分析

以log2|Fold Change|>1&FDR<0.05為標準篩選出樣本間差異表達基因，以未進行酸雨噴淋處理的CK為對照處理，統計酸雨處理樣本表達基因的上下調關系。利用GO和KEGG數據庫對篩選的差異基因進行分析。將差異表達基因在GO數據庫（http：//www.geneontology.org/）各條目進行映射，計算相應條目的基因數，可得條目基因列表和基因數目統計。再通過超幾何檢驗，篩選出差異表達基因中顯著富集的GO條目，假設檢驗的p-value計算公式是：

公式中，Ⅳ是所有Unigene中具有GO注釋的基因數目，n是Ⅳ中差異表達基因數目，M是所有Unigene中注釋為某特定GO條目的基因數目，M是注釋為某GO條目的差異表達基因數目。由公式計算的值通過FDR校正后，當Q值≤0.05時，認為是差異表達基因中顯著富集的GO條目。

同樣通過超幾何檢驗，以KEGG Pathway為單位進行Pathway顯著性富集分析。

1.5次生代謝相關酶PCR分析

選擇4個與次生代謝相關的差異顯著基因[POD同工酶cg39018770和cg29001440、肉桂酰輔酶A還原酶（ CCR）同T酶cglg021310、4一香豆酸一輔酶a連接酶（ 4CL）同T酶cg39029290]進行驗證，內參基因選用Cg39024100（tubulin beta-6 chain）參考王莉嬛等的研究[2]，反應體系按照表l配制，引物序列見表2。PCR反應條件：95℃90 s，95℃5s，60℃15 s，72℃20 s，40次循環。

1.6數據統計與分析

轉錄組數據在信息分析前對原始數據進行質控，并對數據過濾;按照edgeR的一般過濾標準（log2IFold Changel>1且FDR< 0.05）篩選差異基因;PCR定量分析數值為3次重復平均值，數據作圖采用Origin 8.0軟件。

2結果與分析

2.1葉片傷害表型

由圖1可知模擬酸雨噴淋24 h后，琯溪蜜柚嫩葉出現明顯塊狀傷斑，而對照清水噴淋后嫩葉沒有出現傷斑，表明pH 2.5的模擬酸雨破壞葉表面角質層，損害葉片表皮結構。

2.2轉錄組質量檢測和RAW數據整理分析

由表3可知通過對照組和處理組琯溪蜜柚葉片樣品的轉錄測序，獲得7 361 352 600～9 249 897 000有效數據。對數據進行質控、過濾得到7111 541211～8 926 570 988數據，其030堿基百分比均不小于95.l9%.GC含量均高于44%，表明測序結果可靠，可用于后續分析。

使用短reads比對工具bowtie將過濾后的數據比對到核糖體數據庫中，將比對上核糖體的數據去除，剩下的數據用于轉錄組的組裝和分析。未比對上rRNA的reads數量是47756 642～59 953 992，比例在98 .95%～99.36%（表4）。

將過濾完核糖體的數據用轉錄組數據比對軟件TopHat2比對到參考基因組上，能比對上的比例為86.63%～88.59%（表5）。

2.3樣本基因的注釋和差異表達基因的篩選分析

利用Cufflinks進行轉錄本組裝，利用Cuffmerge對多個樣品的組裝結果進行合并，共得到21497個基因，其中20573基因在參考基因組中得到注釋，有924個新基因沒有得到注釋。將這些新基因的轉錄本在Nr、KEGG數據庫進行注釋。

用全體基因的表達量對所有樣本的關系進行層級聚類，層級聚類圖可以真實地反映出每個樣本與其他樣本的關系，圖2顯示對照組3個重復聚為一類，處理組3個重復聚為一類，由此可以得知本試驗處理重復性好。

利用FDR與log2（FC）來篩選差異基因，篩選條件為FDR< 0.05且log2（FC）I>1，結果顯示與對照相比，酸雨處理24 h后組中有879個基因顯著上調，588個基因顯著下調。篩選出樣本中前50個DEGs（差異基因），均為上調表達基因，大部分涉及代謝途徑、次生代謝、苯丙基類丙烷生物合成和萜類物質合成等相關基因。

2.4差異表達基因的Gene Ontology富集分析

Gene Ontology（簡稱GO）是一個國際標準化的基因功能分類體系，分別從分子功能（ Molecular function）、細胞組分（ Cellular component）和生物過程（Biologicalprocess）來描述基因，能夠全面描述生物體中基因和基因產物的屬性，該體系隨著研究的發展而動態更新。對篩選出的差異表達基因做GO功能分析，闡明處理差異在基因功能上的體現。在GO數據庫中，細胞組成方面有2 101條基因，有97條顯著差異基因，被注釋到56條GO term中，其中GO：0005576extracelluar region（細胞外區域）為差異表達基因中最顯著富集的一個GO term，其次是GO： 0030312external encapsulating structure。在GO數據庫中，分子功能方面有4 686條基因，有279條顯著差異基因，被注釋到206條GO term中，其中GO：0003824catalytic activity（催化劑活性）為在差異表達基因中最顯著富集的一個GO term，其次是GO：0016491oxidoreductase activity（氧化還原酶活性）。在GO數據庫中，生物過程方面有4 355條基因，有245條顯著差異基因，被注釋到409條GO term中，其中GO：0006259 DNA metabolic process（DNA代謝過程）為在差異表達基因中最顯著富集的一個GO term，其次是GO： 0009620 response to fungus（對真菌的響應）。表6是對差異基因按上下調進行GO term的分類統計。

2.5差異表達基因的KEGG富集分析

KEGG是代謝通路（Pathway）的主要公共數據庫，差異表達基因Pathway顯著性富集分析能確定這些差異表達基因參與的最主要的代謝和信號轉導途徑。本研究中有5 845條基因被注釋到KEGG數據庫的99條Pathway中，對照和處理組間有303條基因表達差異顯著。圖3顯示差異表達基因中最為顯著富集的前20條Pathway（按照Qvalue），其中k003030DNA replication Pathway是差異表達基因中最顯著富集的Pathway，在這條通路中有20個基因顯著差異表達，與對照相比多為上調表達;其次是次生代謝的生物合成，在這條通路中有121個基因顯著差異表達，與對照相比多為上調表達;再次是苯丙素類合成途徑，有33個基因顯著差異表達，與對照相比多為上調表達;接著是同源重組通路，有14個基因顯著差異表達，與對照相比均為下調表達。

2.6次生代謝合成相關酶PCR分析

選擇4個與次生代謝相關的差異顯著基因[ POD同工酶cg3g018770和cg2g001440、肉桂酰輔酶A還原酶（ CCR）同工酶cglg021310、4一香豆酸一輔酶a連接酶（ 4CL）同工酶cg39029290]進行驗證，經過驗證發現這4個基因的實際情況與轉錄組數據一致，cg3g018770、cg2g001440和cglg021310與對照相比均為上調表達，cg39029290與對照相比明顯下調，證明了轉錄組數據的可靠性（圖4）。

3討論與結論

酸雨對植物直接傷害表現為使葉子褪綠、黃化、出現塊狀傷斑、失水萎蔫和早落葉等癥狀，隨著酸度增高和淋溶時間的延長受害越嚴重，一般嫩葉較老葉更易受到傷害[15]。葉片角質層是植物遭遇酸雨脅迫的第一道防線[15]，琯溪蜜柚葉片具有較厚角質層，抗酸雨性較強，張瓊等[12]研究表明中長期酸雨淋洗沒有造成琯溪蜜柚葉片表面的可視性損害，本研究模擬酸雨淋洗的是較嫩葉片，葉片角質層較薄，24 h后就表現出較為明顯的傷塊，說明酸雨侵蝕嫩葉，產生了直接傷害。

酸雨通過氣孔或被損害的葉片表皮進入細胞內部，會破壞代謝平衡，降低植物的光合作用[16-17]，近些年來一些學者從分子生物學水平研究了酸雨對植物的影響。Hu等[6]研究認為酸雨脅迫可使得酸雨抗性物種大多參與基礎代謝、細胞建成、光合和轉錄等過程的蛋白表達水平上調，使得酸雨敏感物種代謝、光合、信號轉導和轉錄相關蛋白表達水平下調，本研究中酸雨處理24 h后琯溪蜜柚葉片有879個基因顯著上調，588個基因顯著下調，而篩選出樣本中前50個DEGs（差異基因），均為上調表達基因，大部分涉及代謝途徑、次生代謝、苯丙基類丙烷生物合成和萜類物質合成等相關基因，由此可以推測琯溪蜜柚對酸雨耐性較強。GO富集分析表明差異表達基因主要位于細胞外區域，催化劑活性是分子功能最為顯著富集的GO term中，其次是氧化還原酶活性，生物過程中差異表達基因最顯著的GO term是DNA代謝過程。對差異基因對照KEGG數據庫進行注釋顯示酸雨脅迫顯著抑制DNA復制通路，促進次生代謝的生物合成，尤其是苯丙素類合成途徑。次生代謝是植物在長期進化中與環境相互作用的結果，是提高植物抗逆性的主要調節機制[18-19]。由此可推測琯溪蜜柚主要是通過抑制DNA復制，影響細胞分裂增殖，進而抑制葉片生長，以此為代價使得植物將更多能量和資源分配給次生代謝來應對酸雨脅迫。選擇次生代謝合成途徑中3個主要基因[ POD同工酶cg39018770和cg29001440、肉桂酰輔酶A還原酶（ CCR）、同工酶cglg021310]進行PCR熒光定量驗證分析，結果也顯示酸雨處理均明顯促進了這3個基因的相對表達，進一步驗證了轉錄組分析的結果。琯溪蜜柚通過調節次生代謝提高耐酸性與擬南芥耐酸機理相似，酸雨脅迫下擬南芥有多個與植物次生代謝相關基因表達量發生變化，木質素、生物堿等次生代謝產物的合成在酸雨處理下加強[11]。

本研究從表型和分子生物學角度研究酸雨脅迫對琯溪蜜柚的影響，結果表明pH 2.5的模擬酸雨侵蝕琯溪蜜柚嫩葉產生直接傷害;酸雨噴淋使得葉片部分基因表達差異顯著，差異表達基因主要位于細胞外區域，對催化劑活性和氧化還原酶活性影響較大，酸雨脅迫顯著抑制DNA復制通路，促進次生代謝的生物合成，尤其是苯丙素類合成途徑。由此可得出琯溪蜜柚對酸雨脅迫的響應是一個多基因參與、多個生物過程協同調控的過程，次生代謝的調節可能是應對酸雨脅迫的主要方式。

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（責任編輯：黃愛萍）

收稿日期：2021-0307初稿;2021-04-15修改稿

作者簡介：張瓊（ 1980-）.女，博士研究生，副教授，研究方向：植物生態學（E-mail： 349369029@qq.com）

基金項目：福建省自然科學基金項目（2020J01810）