良性腦膜瘤原代細胞培養及脂多糖對其增殖的影響

李云峰，張弘池，孫昱皓，卞留貫，王寶鋒

腦膜瘤是常見的中樞神經系統腫瘤，其發病率為1.3/105～7.8/105，僅次于膠質瘤，約占顱內原發性腫瘤的30%[1-2]。雖然近90%的腦膜瘤為良性腫瘤(WHO Ⅰ級)，但由于腦膜瘤常侵犯鄰近的軟組織或顱骨，或由于生長部位鄰近重要結構無法全切，即使Ⅰ級腦膜瘤的復發率也有7%～25%[3]。術后殘留或復發的腦膜瘤是外科醫生面臨的難題，雖然可以采用放射治療或化學治療，但患者仍存在較差的預后[4]。目前對于良性腦膜瘤發生發展的研究仍然較少，需要更多的基礎研究以尋找新的治療方法。本研究培養良性腦膜瘤及柔腦膜原代細胞，并用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)對細胞進行處理，檢測細胞的增殖活力及炎癥因子表達水平；以探討良性腦膜瘤及柔腦膜原代細胞的培養技術和LPS對細胞增殖的影響，以及炎癥與良性腦膜瘤發生發展的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 孕19 d的SD大鼠(購于西譜爾-必凱公司)，飼養于SPF級環境，人工晝夜節律，自由飲食。待娩出新生鼠后，將新生1 d的SD大鼠用于提取柔腦膜原代細胞。動物實驗遵循上海交通大學醫學院動物倫理委員會的要求。腦膜瘤標本取自3例經病理檢查證實為WHO Ⅰ級腦膜瘤的患者，術中切除的腫瘤標本常溫保存送至實驗室提取細胞。所有標本獲取及后續操作均獲得上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院倫理委員會同意。

1.2 方法

1.2.1 腦膜瘤及柔腦膜原代細胞提取 根據文獻介紹的方法[5-6]，用滅菌眼科剪將腦膜瘤標本剪碎成小于1 mm3塊狀組織，置入37 ℃ 0.25%胰蛋白酶中，37 ℃溫箱中消化(根據組織硬度決定消化時間，10～30 min，如組織過硬將無法消化，不能提取細胞)，每2～3 min搖晃1次；10% FBS中和胰蛋白酶，反復吹打組織碎塊形成細胞懸液，離心后以10% FBS DMEM培養液培養原代細胞；48 h后以無血清DMEM培養液純化細胞，之后繼續以10% FBS DMEM培養細胞，2～3 d更換一次培養液。將新生1 d的SD大鼠頸椎脫臼處死后，75%乙醇消毒，體視顯微鏡下剝離柔腦膜，HBSS洗滌后，0.25%胰蛋白酶消化10 min，中和后吹打成細胞懸液。后續培養方法同腦膜瘤原代細胞。

1.2.2 細胞免疫熒光檢測 腦膜瘤原代細胞傳代種植于細胞爬片上，細胞貼附后以4% PFA固定，0.3% Triton處理細胞；10% FBS封閉后加一抗處理，上皮膜抗原(epithelial membrane antigen，EMA)1∶200，波形蛋白(vimentin，VIM)1∶200，過夜孵育；二抗IgG(Alexa Fluor?488，1∶400，Invitrogen) 37 ℃反應1 h。DAPI染色后熒光顯微鏡觀察。

1.2.3 細胞毒性/增殖實驗 實驗采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(碧云天生物)。將原代細胞傳代后種植于96孔板中，每孔種植100 μL 2 000個細胞，培養24 h后加入LPS處理。處理后，更換新培液，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養箱中繼續培育0.5～4 h，最后用酶標儀測吸光度(檢測波長：450 nm)。

1.2.4 實時聚合酶鏈反應(real-time PCR) 采用LPS處理原代細胞，Trizol法提取RNA。根據PubmedGeneBank公布的大鼠及人相關基因序列，應用PrimerExpress 2.0(ABI)軟件設計引物，由Invitrogen(Shanghai)合成(表1)。real-time PCR均采用One Step SYBR?PrimeScriptTMPLUS RT-PCR試劑盒(TakaRa)，根據其說明書配制反應體系。利用ABIHT7900 real-time PCR儀進行PCR反應。實驗以GADPH為內參，校正每個樣品的Ct值，比較每個基因表達差異。ΔCt=目的基因Ct值-GADPH Ct值；ΔΔCt=實驗組ΔCt值-對照組ΔCt值。

表1 real-time PCR引物序列

2 結 果

2.1 原代良性腦膜瘤細胞的培養、鑒定及生長特點所取的3個腦膜瘤標本均為病理證實WHO Ⅰ級腦膜瘤，其中2例為纖維型、1例為內皮型腦膜瘤。良性腦膜瘤原代細胞培養大約12 h后貼壁，此時培養液中漂浮部分死亡細胞或未消化組織碎塊，貼壁細胞呈雙極長梭形，部分可聚集成團。約48 h后需要傳代，傳代細胞用低營養無血清培養基培養(單純DMEM)，以提高腦膜瘤和柔腦膜原代細胞的純度。之后繼續以10% FBS DMEM培養。原代細胞在 1～4代之間生長活躍，增殖能力最強，約2～3 d可傳一代。多數傳至第6代以后，細胞開始出現老化，細胞內包涵體增多，增殖能力明顯下降。腦膜瘤原代細胞的形態為兩極或多極，相互連接成片、束狀排列或聚集成團，胞漿豐富，核大，部分可見包涵體；細胞免疫熒光檢測顯示3個腦膜瘤原代細胞的胞漿中均表達EMA和VIM(圖1)。柔腦膜細胞形態較為均一，大小相對一致，呈成纖維細胞形態，束狀排列或聚集成團(圖2)。

紅色熒光：EMA或VIM；藍光熒光：DAPI；白色標尺=100 μm；黑色標尺=50 μm圖1 腦膜瘤原代細胞的形態及鑒定

2.2 LPS對良性腦膜瘤原代細胞增殖活力的影響良性腦膜瘤及柔腦膜原代細胞傳代后，用不同濃度的LPS(con，10 ng/L，100 ng/L，1 μg/L，10 μg/L)處理細胞12 h，采用CCK-8溶液測定細胞的吸光度(反映細胞增殖活力)。結果顯示，隨著LPS濃度提高，良性腦膜瘤與柔腦膜原代細胞的增殖活力都明顯增加，呈劑量依賴關系；LPS濃度為1 μg/L時細胞增殖活力達峰值；濃度為10 μg/L時出現毒性反應，細胞活力下降(圖3A)。當LPS濃度為1 μg/L時，細胞活力隨著處理時間延長(con，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h)不斷增強，在6 h或12 h達到峰值，呈明顯時間依賴關系(圖3B)。

2.3 LPS對良性腦膜瘤原代細胞炎癥因子表達的影響 經1 μg/L LPS處理6 h后，良性腦膜瘤和柔腦膜原代細胞的3種炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和NF-κB的RNA表達水平均明顯增高(圖4)。

A：IL-1β； B：IL-6； C：TNF-α； D：NF-κB(與對照組比較***P<0.001)圖4 LPS處理后腦膜瘤與柔腦膜細胞的炎癥因子和NF-κB表達水平

3 討 論

腦膜瘤基礎研究中采用的細胞株如IOMM-Lee、CH-157 MN、HKBMM等，主要來源于惡性腦膜瘤；而非典型或良性腦膜瘤的研究，目前還依賴于原代培養技術[7-8]。腦膜瘤的原代培養技術與常見的原代細胞培養方法類似，包括組織塊培養法、機械分離法和化學消化法；前兩者獲得的細胞數量較少，加上良性腦膜瘤細胞增殖能力較弱，培養時間較長，難以得到足夠細胞。化學消化法采用胰蛋白酶直接去除腫瘤的纖維組織或基質，腫瘤細胞充分分離，得到單細胞懸液，容易在短時間內獲得大量的原代細胞。且經過低營養(低血清或無血清)培養基篩選，去除多數雜質細胞，所收獲原代細胞純度高。當然也有文獻報道良性腦膜瘤永生細胞株的建立，采用慢病毒導入端粒酶亞單位(telomerase reverse transcriptase，hTERT)質粒，構建良性腦膜瘤細胞永生株[9-11]。但hTERT本身對于腦膜瘤的發生發展也存在重大影響，導入該質粒后對腦膜瘤的基礎研究可能存在潛在影響，此永生株目前國內也沒有相關報道。本研究采用化學消化法，利用體積較大的腫瘤，一次可以得到大量的原代細胞，有利于實驗的進行。

EMA和VIM是腦膜瘤的兩個主要分子標記物，幾乎所有的腦膜瘤中均有表達[12-14]；因此，EMA和VIM常用于腦膜瘤的病理診斷和腦膜瘤細胞鑒定。本研究的3種良性腦膜瘤原代細胞經免疫熒光檢測，EMA和VIM表達均為陽性，可證實為腦膜瘤細胞。

腦膜由硬腦膜、蛛網膜與軟腦膜組成，蛛網膜和軟腦膜的胚胎來源類似，兩種合在一起稱為柔腦膜，柔腦膜細胞是柔腦膜的主要細胞成分。目前研究認為，柔腦膜不單是腦組織表面的一層阻止腦脊液溢出的屏障，還存在其他更為重要的作用。如在炎癥刺激下，柔腦膜細胞可獨立于膠質細胞影響神經系統內的免疫調節反應；柔腦膜細胞自身也可以合成分泌與神經元相關的神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、轉移生長因子(transfer growth factor,TGF)等，并可在一定條件下轉化為神經干細胞，促進神經系統發育[15-17]。

目前研究較為認可的觀點是腦膜瘤起源于蛛網膜蓋細胞，與柔腦膜關系密切；所以在腦膜瘤相關基礎研究中，常以柔腦膜細胞作為正常對照[5-6]；也有研究直接以蛛網膜細胞作為正常對照組[18]。因人源蛛網膜細胞的來源、分離與純化更為困難，故本研究以大鼠柔腦膜原代細胞為正常對照。雖然獲取柔腦膜組織是在體視顯微鏡下進行，但柔腦膜與膜下腦組織連接較為緊密，在分離時容易同時取下部分小血管和腦組織，造成細胞污染。但由于神經組織細胞為成熟分化細胞，需要較高的培養條件，在低血清或無血清等低營養條件下，污染細胞無法生長進而死亡，所以經過低營養條件培養后可以得到高純度的柔腦膜細胞[16]。本研究中的原代細胞到第3代后應用于下一步實驗檢測。

腫瘤的發生發展與慢性炎癥關系密切。長時間慢性炎癥刺激誘導基因突變，引起癌基因激活和抑癌基因失活，進而促進腫瘤細胞增殖和血管生成；而癌細胞出現侵襲或遠處轉移也與炎癥引起細胞外基質降解相關。同時，在腫瘤自身生長過程中，腫瘤微環境也會通過誘導炎癥細胞或腫瘤細胞本身分泌大量炎性因子，活化炎癥相關信號傳導通路，如NF-κB、STAT3等，提高腫瘤細胞生存、增殖或遠處轉移的能力[19]。本研究中，良性腦膜瘤/柔腦膜原代細胞經LPS處理后增殖活力明顯增強，并與LPS濃度及時間明顯相關。這與LPS在其他腫瘤細胞中的研究結果基本一致[20-22]。

LPS進入培養液后，先與脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein，LBP)結合，LBP將LPS運送至靶細胞膜表面與CD14結合，隨后再聯合Toll樣受體4(toll-like receptor，TLR4)及髓樣分化蛋白2(myeloid differentiation protein-2，MDP-2)形成蛋白復合體。TLR4進一步將信號傳遞給NF-κB和MAPKs通路，最終活化轉錄因子NF-κB，促使靶細胞中各種細胞因子的大量表達[23]。本研究結果顯示，良性腦膜瘤及柔腦膜原代細胞的相關炎性因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB等，在LPS刺激后表達水平明顯增高。而在腦膜瘤標本的檢測也顯示其IL-1β與TNF-α的表達水平明顯高于瘤周正常組織；而且在體內與體外實驗中均證實，塞來昔布可以抑制腦膜瘤生長，提示炎性刺激可以誘導腦膜瘤形成有利于其生存和生長的微環境[24]。

綜上所述，良性腦膜瘤與柔腦膜原代細胞的培養成功為良性腦膜瘤的基礎研究打下了基礎。LPS處理良性腦膜瘤與柔腦膜細胞后，細胞增殖明顯增加，炎性因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α)和NF-κB的表達上調；表明良性腦膜瘤的生長與炎癥有密切關系。